The genetic landscape of ALS/MND in Turkey and alsin protein-related motor neuron pathology in iPSC-derived cortical neurons

Abstract

After Alzheimer's and Parkinson's diseases, Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is the third most common adult-onset neurodegenerative disease, characterized by progressive muscle weakness and atrophy due to the degeneration of both upper and lower motor neurons. ALS exhibits a broad spectrum of phenotypic variability and involves complex genetic factors. Approximately 10-15% of patients inherit the disease from their parents while the remainder appear sporadic. Monogenic mutations in various genes, particularly C9ORF72, SOD1, TARDBP and FUS, account for disease development in 70% of familial and 5-8% of sporadic cases worldwide, pointing to the strong genetic component in ALS pathophysiology. In the first part of this PhD thesis, the genetically heterogeneous, yet inbred Turkish population was investigated to explore and revisit the basis of ALS genetics. A cohort of 1200 index patients of Turkish origin were included in the study, 15% (176/1200) having familial ALS. Parental consanguinity was present in 14.1% (170/1200) of cases and in 26.5% (319/1200) of patients, the parents were from the same region. All patients were tested for C9ORF72 hexanucleotide repeat expansion. The HRE mutation was detected in 27% (47/176) of familial and 2% (23/1024) of sporadic cases. Further genetic analysis was conducted on 577 patients, using Next Generation Sequencing techniques. The most frequently implicated genes in the cohort were SOD1 (n=33), OPTN (n=18), TARDBP (n=10) and FUS (n=5), which, together with C9ORF72, explained 47% of familial and 4.7% sporadic cases. Additionally, 10% of the familial and 3% of sporadic cases were solved with rare ALS-associated genes, pointing to a strong locus heterogeneity among the Turkish cohort under study Genetic analysis in some families uncovered unique and previously unrecognized situations that diverge from the established inheritance patterns and phenotypic associations reported in other studies. These findings emphasize the significance of our research in revealing novel mechanisms and underscore the critical role of genetics in the pathophysiology of ALS. Homozygous loss of function (lof) mutations in the alsin Rho guanine nucleotide exchange factor ALS2 (ALS2) gene are responsible for three distinct juvenile motor neuron diseases: jALS, IAHSP and jPLS. The alsin protein, encoded by the ALS2 gene, contains three domains with putative guanine exchange factor activity for Ras superfamily GTPases. Disruptions in these domains have been shown to cause neuronal dysfunction, ultimately leading to neurodegeneration. In the second part of this thesis, a patient with a homozygous termination mutation in ALS2 gene was studied and the consequences of alsin lof in patient-derived iPSCs and induced cortical neurons were investigated. Our study revealed that alsin-deficient cell lines exhibit defects in endovesicular trafficking, along with significant impairments and delays in receptor-mediated endocytosis. Additionally, decreased activation of Rac1-GTPase and prominent morphological abnormalities were observed in these cells. This research is significant in presenting the alsin pathophysiology in patient-derived induced cortical cells for the first time.Amiyotrofik Lateral Skleroz (ALS), üst ve alt motor nöronların dejenerasyonuna bağlı olarak ilerleyici kas güçsüzlüğü ve atrofisi ile karakterize edilen, Alzheimer ve Parkinson hastalıklarından sonra, yetişkinlerde görülen üçüncü en sık nörodejeneratif hastalıktır. ALS karmaşık genetik faktörleri içeren geniş bir fenotipik spektruma sahiptir. Hastaların yaklaşık %10-15'inde ailesel geçiş görülürken, geri kalanı sporadik olarak ortaya çıkar. Başta majör ALS genleri C9ORF72, SOD1, TARDBP ve FUS olmak üzere çeşitli genlerdeki monogenik mutasyonlar, ailesel vakaların %70'inde ve sporadik vakaların %5-8'inde hastalığın ortaya çıkmasından sorumlu tutulurken, bu bulgular ALS patofizyolojisindeki güçlü genetik temele işaret etmektedir. Bu doktora tezinin ilk bölümünde, etnik olarak heterojen olan ve yüksek oranda akraba evliliği görülen Türk toplumundaki ALS olgularında hastalığa neden olan genetik faktörler araştırıldı. Çalışmaya dahil edilen 1200 indeks hastanın %15'inde (176/1200) aile öyküsü gözlendi. Olguların %14,1'inde (170/1200) anne-baba akrabalığı mevcuttu. Tüm hastalarda ilk aşamada C9ORF72 hekzanükleotid tekrar artışı araştırıldı. Bu mutasyon ailesel vakaların %27'sinde (47/176), sporadik olguların ise %2'sinde (23/1024) tespit edildi. Yeni Nesil Dizileme yöntemleri kullanılarak toplamda 577 hasta üzerinde ileri genetik analiz yapıldı. Bu analizle en yaygın olarak SOD1 (n=33), OPTN (n=18), TARDBP (n=10) ve FUS (n=5) genlerinde mutasyon gözlenirken, C9ORF72 ekspansiyonu da dahil edildiğinde, ailesel vakaların %47'si ve sporadik vakaların %4,7'si açıklandı. Ayrıca, ailesel vakaların %10'u ile sporadik vakaların %3'ünde saptanan ALS ile ilişkili nadir genler, incelenen kohorttaki güçlü lokus heterojenitesine işaret etti. . Bu çalışma çerçevesinde yapılan analizler ve alınan sonuçlar, Türk toplumunda literatürde kabul gören kalıtım modellerinde ve genotip-fenotip korelasyonundaki farklılıklara da işaret etti. Bulgular, genetik araştırmaların yeni mekanizmaları ortaya çıkarmasındaki önemini vurgulamakta ve genetiğin ALS patofizyolojisinin anlaşılmasındaki kritik rolünün altını çizmektedir. Alsin Rho guanin nükleotid değişim faktorü ALS2 (ALS2) genindeki homozigot fonksiyon kaybı mutasyonları üç farklı juvenil motor nöron hastalığıyla ilişkilendirilmiştir: jALS, IAHSP and jPLS. ALS2 geni tarafından kodlanan alsin proteini, Ras süper ailesi GTPazları için guanin değişim faktörü aktivitesine sahip üç domain içerir. Bu domainlerdeki bozulmaların nöronal işlev bozukluğuna neden olduğu ve nörodejenerasyona yol açtığı gösterilmiştir. Bu tezin ikinci bölümünde , ALS2 geninde homozigot erken sonlanma mutasyonu olan bir olgu incelendi ve hastadan elde edilen iPSC'ler ile indüklenmiş kortikal nöronlarda alsin fonksiyon kaybının sonuçları araştırıldı. Çalışmamız, alsin proteini sentezlenmeyen hücre hatlarının, reseptör aracılı endositoz ve endoveziküler trafik yolaklarında işlev bozuklukları meydana geldiğini gösterdi. Bu bulgulara ilave olarak, hasta hücre hatlarında Rac1-GTPaz aktivasyonunda azalma ve belirgin morfolojik anormallikler de gözlemlendi. Araştırmanın bu kısmı, alsin patofizyolojisinin hastadan elde edilen indüklenmiş kortikal nöronlarda ilk kez gösterilmesi açısından önemlidir.