Deciphering the structural stability and oligomeric state of HERC5 HECT domain by SAXS

Abstract

ISG15, interferon-stimulated gene 15, is a ubiquitin-like protein induced by type I interferon (IFN). The functions and interactions of ISG15 within the cell are determined by two tandem ubiquitin-like domains. Similar to ubiquitin, ISG15 binds to cellular proteins via the action of the E1-E2-E3 enzyme complex, known as ISGylation. HERC5 (HECT And RLD Domain Containing E3 Ubiquitin Protein Ligase 5) is an E3 ubiquitin ligase that plays a critical role in the conjugation of ISG15 and enhances the antiviral response by inhibiting viral replication. The HECT (Homologous to the E6-AP Carboxyl Terminus) domain is the one of the domains of HERC5 that catalyzes the conjugation process via catalytic binding of cysteine at the 944th position. There is no consensus regarding the initiation site and the length of the HECT region. Some researchers have proposed the inclusion of an additional N-terminal alpha helix structure within this region. In Chapter 2, HERC5 HECT domain were produced and purified using different expression plasmids (pQE-60, pET42), fusion tags (SUMO, GST), expression hosts (E. coli Rosetta 2 strain for both pQE-60 and pET42, and Gami strain for pQE-60), a range of temperatures (30°C, 25°C, 21°C, and 16°C), and varying IPTG concentrations (0.2 μMand 0.04 μM) to investigate factors affecting the stability of the boundaries of the HECT domain. Proteins were purified by affinity chromatography, the gravity-flow column with Ni-NTA resin. All samples were visualized by sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis with 15% gels.

ISG15, interferonla uyarılan gen 15, tip I interferon (IFN) tarafından indüklenen ubikitin benzeri bir proteindir. ISG15'in hücre içindeki işlevleri ve etkileşimleri iki ubikitin benzeri alan tarafından belirlenir. Ubikitine benzer şekilde ISG15, ISGilasyon olarak bilinen E1-E2-E3 enzim kompleksinin etkisiyle hücresel proteinlere bağlanır. HERC5 (E3 Ubiquitin Protein Ligaz 5 İçeren HECT ve RLD Alanı) , ISG15'in konjugasyonunda kritik bir rol oynayan ve viral replikasyonu inhibe ederek antiviral yanıtı artıran bir E3 ubikitin ligazdır. HECT (E6-AP Karboksil Sonuna Homolog) alanı, HERC5'in 944. pozisyonda sisteinin katalitik bağlanması yoluyla konjugasyon sürecini katalize eden alanlarından biridir. Başlangıç bölgesi ve HECT bölgesinin uzunluğu konusunda bir fikir birliği yoktur. Bazı araştırmacılar bu bölgeye ek bir N-terminal alfa heliks yapısının dahil edilmesini önermişlerdir. Bölüm 2'de, HERC5 HECT alanının sınırlarının kararlılığı etkileyen faktörleri araştırmak için farklı ifade plazmidleri (pQE-60, pET42), füzyon etiketleri (SUMO,GST), ifade konakçıları (pQE-60 ve pET42 için E. coli Rosetta 2 suşu ve pQE-60 için Gami suşu), bir dizi sıcaklık (30°C, 25°C, 21°C ve 16°C) ve değişen IPTG konsantrasyonları (0,2 μM ve 0,04 μM) kullanılarak üretilmiş ve saflaştırılmıştır. Proteinler, Ni-NTA reçineli yerçekimi akışlı kolon olan afinite kromatografisi ile saflaştırılmıştır. Tüm örnekler %15'lik jellerle sodium dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi ile analiz edilmiştir. HERC5'in HECT alanına özgü oligomerizasyon kapasitesi tam olarak açıklığa kavuşturulmamıştır. Bölüm 3'te, HERC5 HECT afinite kromatografisi ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) saflaştırılmış, ardından çözeltideki moleküler organizasyonu ve oligomeric durumu, küçük açılı X-ışını saçılma (SAXS) ile karakterize edilmiştir. Sürdürülebilir enerji üretimi ve çevre korumanın yaygınlaşmasıyla birlikte, metal içermeyen fotokatalizörlerin kullanımı birçok kimyasal dönüşümde giderek daha önemli hale gelmiştir. Grafit karbon nitrür (g-CN), 2,7 eV civarında bant aralığına sahip, metal içermeyen, kimyasal ve fiziksel kararlılığa sahip bir yarı iletken fotokatalizördür. Tüm bu özelliklerinin yanı sıra, g-CN'nin hızlı yük foto-indüklenmiş taşıyıcı rekombinasyonu, zayıf görünür ışık absorbsiyonu gibi bazı eksiklikleri vardır. Bunu ele almak için, kusur mühendisliği kullanılarak elde edilen azot boşlukları modifiye edilmiş grafitik karbon nitrür (Nk-gCN) sentezi ortaya çıkmıştır. Bölüm 4'te, g-CN ve Nk g-CN'nin morfolojik, yapısal ve optik özellikleri X-Işını Kırınımı (XRD), Geçirimli Elektron Mikroskobu (TEM), Yüksek Açılı Açısal Karanlık Alan (HAADF)-Taramalı Tem, Element haritalama, X-ışını Fotoelektron Spektroskopisi (XPS), UV-Vis-NIR Dağınık Yansıma Spektroskopisi (DRS) ve Fotolüminesans (PL) ile karakterize edilmiş ve karşılaştırılmıştır. Benzil alkolün benzaldehite seçici oksidasyonu gCN ve Nv-gCN fotokatalizörü kullanılarak başarıyla gerçekleştirilmiştir. GC-MS (Gaz Kromatografisi- Kütle Spektroskopisi) ile yapılan kalitatif analiz kullanılarak oksidasyon reaksiyonları için gCN ve N-vacancy g-CN'nin verimliliğini ve seçiciliğini karşılaştırmıştır.