Tissue engineered models for lung cancer

Abstract

Lung cancer remains the leading cause of cancer-related deaths worldwide, with limited clinical models available to recapitulate the complex tumor microenvironment (TME) that drives disease progression and therapy resistance. The extracellular matrix (ECM), a critical component of the TME, is profoundly altered in lung tumors, exhibiting changes in composition, stiffness, and biochemical signaling. Among these, proteoglycans (PG) and their sulfated glycosaminoglycan (sGAG) side chains are emerging as key modulators of tumor behavior. However, their specific roles in cancer progression remain poorly defined due to the lack of physiologically relevant models. This thesis aims to elucidate the role of ECM-derived cues, particularly sGAG content and matrix stiffness, on lung cancer progression and to develop biomimetic three-dimensional (3D) hydrogel systems that mimic the lung tumor ECM. Initially, native lung ECM-derived reconstituted hydrogels were developed via decellularization of bovine lung tissues utilizing four different protocols. Decellularized lung ECM demonstrated similar matrix composition to human lungs with less batch-to- batch variability. Decellularization strategy had a strong impact on the mechanical properties of reconstituted hydrogels such as stiffness and stress relaxation. Hydrogels were shown to support optimal growth of lung tumor cells as well as healthy pulmonary epithelium with distinct morphological changes in response to matrix mechanics. Subsequently, to dissect the role of ECM sulfation in the lung tumor microenvironment, double-network hydrogels were generated through combination of decellularized lung matrices with alginate sulfate, an sGAG-mimetic which allows tunable sulfation. Sulfated matrices strongly promoted proliferation of lung adenocarcinoma cells as well as activation of epithelial-mesenchymal transition and stemness programs. Mechanistic studies confirmed activation of a distinct set of receptor tyrosine kinases (RTK) through the sulfated extracellular microenvironment and downstream PI3K signaling inducing a tumorigenic behavior. Next, the synergy of tumor matrix stiffness with matrix composition was studied using mechanically tunable hydrogel systems which constitute of either organotypic lung matrix or tumor-derived reconstituted basement membrane (rBM). ECM composition had a profound effect on mechanical stiffening-mediated regulation of tumor cell behavior. Stiffening on a tumorigenic matrix backbone supported an invasive phenotype while stiffening on organotypic matrices suppressed EMT and stemness in lung tumor cells. Mechanistic studies and transcriptomic analyses revealed PI3K as a crucial effector in relaying mechanical signals with context-dependent and antagonistic roles depending on ECM composition. Finally, we established a patient-derived 3D tumor organoid platform for lung squamous cell carcinoma (LUSC) to evaluate how tumor-specific ECM features affect cancer heterogeneity and cell states. LUSC patient tumors were found to upregulate PG expression compared to native tissues with concomitant increase in sGAG levels. Organoids developed in tumor-mimetic sulfated ECM hydrogels retained squamous morphology, showed enhanced expression of stemness markers such as CD133 and SOX2, and preserved the transcriptomic landscape of their parental tumors more faithfully than conventional matrices. Overall, this thesis presents a series of rationally engineered 3D hydrogel systems that model the mechanical and biochemical complexity of the lung tumor ECM. The findings highlight the importance of sulfated ECM and stiffness in shaping tumor phenotype, signaling, and therapy response. These platforms provide valuable tools for studying tumor biology and hold potential for applications in precision oncology and drug screening.Akciğer kanseri, dünya genelinde kansere bağlı ölümlerin başlıca nedenlerinden biri olmaya devam etmektedir ve hastalığın ilerlemesini ve tedaviye direnci yönlendiren tümör mikroçevresinin (TME) karmaşıklığını yansıtan klinik modellerin eksikliği hâlen önemli bir sorundur. TME'nin kritik bileşenlerinden biri olan hücre dışı matriks (ECM), akciğer tümörlerinde belirgin şekilde değişime uğramakta; bileşimi, sertliği ve biyokimyasal yapısı tümör progresyonu üzerinde önemli etkiler yaratır. Bu bağlamda, proteoglikanlar (PG) ve bunların sülfatlanmış glikozaminoglikan (sGAG) yan zincirleri, tümör davranışını düzenleyen önemli etmenler olarak öne çıkmaktadır. Ancak, bu bileşenlerin kanser ilerlemesindeki spesifik rolleri, fizyolojik olarak anlamlı modellerin eksikliği nedeniyle yeterince aydınlatılamamıştır. Bu tez, ECM'den türeyen sinyallerin, özellikle sGAG içeriği ve matriks sertliğinin, akciğer kanseri ilerlemesi üzerindeki etkilerini ortaya koymayı ve akciğer tümörü ECM'ini taklit eden biyomimetik üç boyutlu (3B) hidrojel sistemlerinin geliştirilmesini amaçlamaktadır. İlk olarak, dört farklı deselülarizasyon protokolü kullanılarak sığır akciğer dokularının hücresizleştirilmesiyle elde edilen yeniden yapılandırılmış ECM bazlı doğal hidrojel sistemleri geliştirildi. Hücresizleştirilmiş akciğer ECM'si, insan akciğer dokusuna benzer bir matris bileşimi sergiledi ve üretim partileri arasında daha düşük değişkenlik gösterdi. Uygulanan deselülarizasyon yöntemleri, yeniden yapılandırılmış hidrojellerin sertlik ve stres gevşemesi gibi mekanik özellikleri üzerinde belirgin farklılıklara yol açtı. Elde edilen hidrojeller hem sağlıklı akciğer epitel hücreleri hem de akciğer tümör hücrelerinin büyümesini destekledi; ayrıca hücrelerin morfolojisi, matrisin mekanik özelliklerine duyarlı şekilde değişiklik gösterdi. Ardından, akciğer tümör mikroçevresinde ECM sülfasyonunun rolünü anlamak amacıyla, hücresizleştirilmiş akciğer matrisi ile sülfatlanmış alginat (alginate sulfate) polimerinin kombinasyonuyla çift ağ yapılı hidrojeller üretildi. sGAG benzeri özellik taşıyan bu sülfatlanmış polimer, kontrollü sülfasyon düzeyine olanak tanıyarak ECM'in biyokimyasal etkilerini modelledi. Sülfatlanmış hidrojeller, akciğer adenokarsinom hücrelerinde proliferasyonu, epitel-mezenkimal geçişi (EMT) ve kök hücre benzeri özelliklerin aktivasyonunu güçlü şekilde indükledi. Mekanistik analizler, sülfatlanmış ECM'nin, belirli reseptör tirozin kinazları (RTK) aktive ettiğini ve bunun PI3K sinyallemesi aracılığıyla tümörijenik hücresel programları harekete geçirdiğini ortaya koydu. Devamında, ECM kompozisyonu ile matriks sertliğinin sinerjik etkileri, mekanik olarak ayarlanabilir hidrojel sistemleri kullanılarak analiz edildi. Bu sistemler, ya organotipik (sağlıklı doku kaynaklı) akciğer ECM'si ya da tümör türevi yeniden yapılandırılmış bazal membran (rBM) içermekteydi. ECM kompozisyonu, matriksin sertleşmesine hücresel yanıtlar üzerinde önemli bir belirleyici oldu. Tümöre özgü matriks üzerinde sertleşme, invazif bir fenotipi desteklerken; organotipik ECM'deki sertleşme, EMT ve kök hücre benzeri özelliklerin baskılanmasına neden oldu. Mekanotransdüksiyonun temel aracı olarak PI3K yolu tanımlandı ve bu yolun, ECM kompozisyonuna bağlı olarak zıt roller üstlendiği gösterildi. Son olarak, akciğer skuamöz hücreli karsinomuna (LUSC) özgü ECM özelliklerinin tümör heterojenliği ve hücresel durumlar üzerindeki etkisini değerlendirmek amacıyla, hasta kaynaklı 3B tümör organoid platformu geliştirildi. LUSC hasta tümörlerinde, normal dokulara kıyasla PG ekspresyonunun ve buna bağlı olarak sGAG seviyelerinin belirgin şekilde arttığı gösterildi. Sülfatlanmış ECM içeren tümör benzeri hidrojellerde büyütülen organoidler, skuamöz morfolojilerini korudu, CD133 ve SOX2 gibi kök hücre belirteçlerinin ekspresyonunu artırdı ve konvansiyonel matrislere kıyasla orijinal tümörlerin transkriptomik imzasını daha yüksek düzeyde korudu. Sonuç olarak, bu tez, akciğer tümör ECM'inin mekanik ve biyokimyasal karmaşıklığını modelleyen bir dizi rasyonel tasarımlı 3B hidrojel platformunu sunmaktadır. Elde edilen bulgular, ECM sülfasyonu ve sertliğinin, tümör hücre fenotipi, sinyal yolakları ve tedavi yanıtları üzerindeki belirleyici etkilerini vurgulamaktadır. Bu modeller, tümör biyolojisinin araştırılmasında güçlü araçlar sunmakta ve hassas onkoloji uygulamaları ile ilaç taramaları için potansiyel teşkil etmektedir.