Engineering design of in vitro mono-culture model of blood-brain barrier and investigation of methotrexate permeability on the model

Abstract

Blood-brain barrier (BBB) is a control mechanism that limits the diffusion of many substances to central nervous system through blood, and governs the nutrient diffusivity. This barrier is among the main risk factors for treatment of neurodegenerative diseases, because most drugs designed are protein based, and are either blocked by BBB, or lose their bioavailability significantly. In this study, an in vitro BBB model was designed for testing therapeutics for neurodegenerative diseases, and methotrexate drug permeability was investigated. In the BBB model design step, polycaprolactone fiber surfaces were prepared by electrospinning to be used as support membrane for cells. The fiber morphology and sizes were determined using polarizing microscopy. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and C6 glioma cells were cultured on either side of this membrane. Model’s proximity to in vivo models was tested by home-designed transendothelial electrical resistance measuring device; and nicotine was used as a positive control and albumin as a negative control. The effect of Methotrexate was determined indirectly by vitality test, MTT, for MCF-7 breast cancer cells seeded on the bottom of the well plates. The model’s proximity to models in the literature and natural blood-brain barrier was specified relatively. / Kan-beyin bariyeri (KBB), çoğu maddenin kandan merkezi sinir sistemine geçişini kısıtlayan, merkezi sinir sistemine besin geçirgenliğini kontrol eden sistemdir. Nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde bu bariyer en önemli risk faktörlerinin başındadır, çünkü bu hastalıklara yönelik ilaçların çoğunun protein bazlı olması bu engelde takılmalarına ya da biyoyararlanımlarını büyük ölçüde kaybetmelerine yol açmaktadır. Bu çalışmada, KBB’nin nörodejeneratif hastalıklara karşı geliştirilecek tedavilerin değerlendirilmesinde model olarak kullanılabilecek bir in vitro modelinin üretilip metotreksatın bariyerden geçişinin incelenmesi amaçlanmıştır. KBB model kurulma aşamasında hücrelere destek membran görevi görmek üzere elektro-eğirme yöntemiyle polikaprolakton (PCL) fiber yüzeyler üretilmiştir. Polarize mikroskopta bu fiberlerin morfolojisi ve boyutları belirlenmiştir. PCL fiberleri üzerinde her bir yüzeye insan kaynaklı göbek kordonu endotel hücreleri (HUVEC) ve C6 glioma hücreleri ekilerek kültive edilmiştir. Tasarlanıp üretilen transendotelyal elektrik direnci (TED) ölçme cihazıyla modelin elektrik direnci ölçülüp, nikotin pozitif kontrolü ve albümin negatif kontrolüyle modelin gerçeğe yakınlığı test edilmiştir. Metotreksat geçişi ise kültür kabının tabanına ekilen meme kanseri hücresi olan MCF-7 üzerindeki etkisi ile dolaylı olarak MTT canlılık testi ile belirlenmiştir. Modelin in vivo kan-beyin bariyerine olan benzerliği bağıl olarak belirtilmiştir.