Dissecting centriolar satellite function using inducible genetic tools

Abstract

Abstract: Centriolar satellites are membraneless granules that facilitate protein trafficking to the centrosome and primary cilium, but the principles governing their assembly, dynamics, and functional roles remain poorly defined. Here, we introduce two chemogenetic tools to manipulate satellite organization. First, chemically inducible Kin-14 motor protein-based trafficking system acutely concentrates satellite granules at the centrosome, altering client protein organization. This centrosomal foci created by PCM1 and other clients, behave like a solid compartment and does not dissolve during mitosis. Functionally, forced satellite accumulation disrupts mitotic progression, proper spindle formation, and chromosome congression. In our second system, we are utilizing a chemically inducible centriolar satellite dimerization assay to regulate the multimerization state of PCM1. Ligand-induced dimerization changes satellite organization by enlarging the granules and reducing their numbers. Notably, satellite multimerization prevents their mitotic dissolution and disrupts Hedgehog signaling but does not affect cilium assembly. Finally, we applied a high-throughput image-analysis pipeline to patient derived fibroblasts bearing mutations in ciliopathy related genes and showed that there are no significant differences in satellite number, intensity, or spatial distribution compared to control cells. Together, this thesis establishes various chemical assays for acute perturbation of centriolar satellites, demonstrate that dynamicity and multivalency are critical for proper centriolar satellite function, and indicate that satellite mislocalization and content is not a universal feature of ciliopathies.

Özet: Sentriyoler satelitler, membransız granüller olarak sentrozoma ve primer silyuma protein taşınmasında görev alır; ancak bunların oluşumu, dinamikleri ve rolleri henüz tam olarak tanımlanmamıştır. Bu çalışmada, insan hücrelerinde satelitlerin organizasyonunu manipüle etmek için iki kemogenetik araç tanıtıyoruz. Öncelikle, kimyasal olarak indüklenen Kin-14 motor proteini tabanlı trafik sistemi, satelit granüllerini hızla sentrozoma yoğunlaştırıp diğer satelit proteinlerinin de organizasyonunu değiştirdi. PCM1 ve satelit proteinlerinden oluşan bu sentrozomal parçalar katı gibi davrandı ve mitoz sırasında çözünmedi. İşlevsel olarak, zorunlu sentrozomal kümelenmesi mitotik ilerlemeyi, doğru iğ oluşumunu ve kromozom kongresyonunu bozdu. İkinci sistemimizde ise PCM1'in multimerizasyon durumunu değiştirmek için kimyasal olarak indüklenen bir sentriyoler uydu dimerizasyon sistemi kullanıyoruz. Ligand kaynaklı dimerizasyon, granülleri büyütüp sayılarını azaltarak satelit organizasyonunu değiştirdi. Önemli olarak, satelit multimerizasyonu granüllerin mitoz esnasında çözünmesini engelledi ve Hedgehog sinyal iletimini bozdu, fakat silyum oluşumunu etkilemedi. Son olarak, silyopati hastalığı ile ilişkili genlerde mutasyonlar taşıyan hasta kökenli fibroblastlara uygulanan yüksek verimli görüntü analiz çalışması, satelit sayısı, yoğunluğu veya uzaysal (spatial) dağılım açısından kontrol hücreleriyle anlamlı farklılıklar göstermedi. Birlikte, bu çalışmalar sentriyoler uyduların akut pertürbasyonu için çeşitli kimyasal deneyler geliştirilmesini sağlayıp, satelitlerin dinamikliğinin ve multimerik regülasyonun mitotik ilerleme ve silya sinyal iletimi için kritik olduğunu göstermektedir. Bunun yanı sıra, satelitlerin içeriğinin ve hücre içerisinde yanlış konumlanmasının tüm silyopatilerde ortak bir özellik olmadığını göstermektedir.