The in vitro effect of mesenchymal stem cell-conditioned medium on retinal oxidative stress

Abstract

This study aims to evaluate the effect of conditioned medium (CM) derived from adipose and limbal tissue-derived mesenchymal stem cells (MSC) on cell survival, cell cycle, inflammation, autophagy and angiogenesis in retinal pigment epithelial (RPE) cells stressed with hydrogen peroxide (H₂O₂). In addition, the effect of storage conditions on the anti-inflammatory properties of adipose-derived MSC-CM (ADMSC-CM) and the protective effects of lyophilized ADMSC-CM against age-related autophagy impairment were investigated. MSC-CM was applied to RPE cells stressed with H₂O₂. Cell viability was assessed by MTT assay and cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry. Inflammatory responses were measured by RT-qPCR and Western blotting for key cytokines and signaling proteins. Angiogenic potential was analyzed by VEGF ELISA and HUVEC migration and survival assays. The effects of storage conditions of ADMSC-CM were examined by considering the effects of concentrated and lyophilized CM on markers of inflammation. Finally, the protective role of lyophilized ADMSC-CM against autophagy mechanisms was evaluated by pretreatment and subsequent exposure of RPE cells to H₂O₂; cell viability, LDH release, ATP levels and mitochondrial function were analyzed. Both ADMSC-CM and LMSC-CM significantly increased RPE cell survival after H₂O₂ treatment. MSC-CM from both sources attenuated the G2/M phase arrest induced by H₂O₂. MSC-CM reduced the expression of inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6 and IL-10) and inhibited the p38 MAPK signaling pathway. Lyophilized ADMSC-CM showed a significant reduction in inflammation markers compared to concentrated CM. MSC-CM decreased the Bax/Bcl-2 ratio and modulated autophagy-related proteins such as LC3 and p62. Pretreatment with lyophilized ADMSC-CM increased cell viability, reduced LDH release and maintained ATP levels. MSC-CM showed a significant alteration on HUVEC migration and survival, although it did not affect released VEGF levels. Lyophilized ADMSC-CM played a protective role against oxidative stress-induced mitochondrial damage by preserving mitochondrial membrane potential through autophagy pathway. In particular, MSC-CM derived from adipose tissue improves the survival and function of H₂O₂-treated RPE cells by modulating cell cycle arrest, inflammation and autophagy mechanisms. Lyophilized ADMSC-CM retains its anti-inflammatory properties and shows protective effects against age-related autophagy impairments, making it a promising candidate for clinical applications in the treatment of retinal diseases associated with oxidative stress and inflammation.Bu çalışma, hidrojen peroksit (H₂O₂) ile strese uğratılmış retinal pigment epitel (RPE) hücrelerinde adipoz ve limbal doku kaynaklı mezenkimal kök hücrelerden (MSC) elde edilen koşullandırılmış besiyerin (CM), hücre yaşamı, hücre döngüsü, inflamasyon, otofaji ve anjiyogenez üzerine değerlendirmeleri amaçlamaktadır. Ayrıca, adipoz kökenli MSC-CM (ADMSC-CM) depolama koşullarının anti-inflamatuvar özelliklerine etkisi ve yaşa bağlı otofaji bozulmalarına karşı liyofilize edilmiş ADMSC-CM'in koruyucu etkileri incelenmiştir. MSC-CM, H₂O₂ ile stres oluşturulan RPE hücrelerine uygulanmıştır. Hücre yaşamı MTT testi ile değerlendirilmiş ve hücre döngüsü dağılımı akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. İnflamatuvar tepkiler, temel sitokinler ve sinyal proteinleri için RT-qPCR ve Western blot ile ölçülmüştür. Anjiyogenik potansiyel, VEGF ELISA ve HUVEC göç ve yaşam testleri ile analiz edilmiştir. ADMSC-CM'nin depolama koşullarının etkileri, konsantre edilmiş ve liyofilize CM'nin inflamasyon belirteçlerine etkileri göz önüne alınarak incelenmiştir. Son olarak, liyofilize ADMSC-CM'nin otofaji mekanizmalarına karşı koruyucu rolü, RPE hücrelerinin ön tedavi edilmesi ve ardından H₂O₂'ye maruz bırakılması ile değerlendirilmiş; hücre yaşamı, LDH salınımı, ATP seviyeleri ve mitokondriyal fonksiyon analiz edilmiştir. Hem ADMSC-CM hem de LMSC-CM, H₂O₂ tedavisinden sonra RPE hücre yaşamını önemli ölçüde artırmıştır. Her iki kaynaktan elde edilmiş MSC-CM, H₂O₂ tarafından indüklenen G2/M faz durmasını hafifletmiştir. MSC-CM, inflamatuvar sitokinlerin (IL-1β, IL-6 ve IL-10) ekspresyonunu azaltmış ve p38 MAPK sinyal yolunu inhibe etmiştir. Liyofilize ADMSC-CM, konsantre edilmiş CM ile karşılaştırıldığında inflamasyon belirteçlerinde anlamlı bir azalma göstermiştir. MSC-CM, Bax/Bcl-2 oranını azaltmış ve LC3 ve p62 gibi otofaji ile ilgili proteinleri modüle etmiştir. Liyofilize ADMSC-CM ile ön tedavi, hücre yaşamını artırmış, LDH salınımını azaltmış ve ATP seviyelerini korumuştur. MSC-CM, salınan VEGF seviyelerini etkilememesine rağmen, HUVEC göçü ve yaşamı üzerinde anlamlı bir değişiklik göstermiştir. Liyofilize ADMSC-CM, mitokondriyal membran potansiyelini koruyarak oksidatif stres kaynaklı mitokondriyal hasara karşı, otofaji yolağını kullanarak, koruyucu bir rol üstlenmiştir. Özellikle adipoz dokudan elde edilen MSC-CM, H₂O₂ ile tedavi edilen RPE hücrelerinin yaşamını ve fonksiyonunu hücre döngüsü durması, enflamasyon ve otofaji mekanizmalarını modüle ederek iyileştirmektedir. Liyofilize ADMSC-CM, anti-inflamatuvar özelliklerini korumakta ve yaşa bağlı otofaji bozulmalarına karşı koruyucu etkiler göstermektedir; bu da onu oksidatif stres ve inflamasyon ile ilişkili retinal hastalıkların tedavisinde klinik uygulamalar için umut verici bir aday yapmaktadır.