Regulatory role of EML1 in microtubule organization and cell division

Abstract

Microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs) are crucial for regulating diverse cellular processes, including intracellular transport, spindle formation, and cell division, all of which are critical for ensuring proper brain development and cortical organization. Among these, EML1 is a MAP that has been associated with subcortical heterotopia, yet its molecular role in microtubule organization and the consequences of disease-associated mutations remain incompletely understood. To investigate the regulatory role of EML1, CRISPR-Cas9-mediated knockout in HeLa cells and Eml1 conditional knockout neural progenitors obtained from E14.5 mouse forebrain were used. Exogenous expression of GFP-tagged wild-type or disease-causing T243A mutant EML1 was employed to assess the impact of the mutation on microtubule binding and cellular phenotypes. A combination of microtubule pelleting assays, confocal immunofluorescence imaging, label-free quantitative proteomics, and live-cell imaging was applied to evaluate microtubule stability, MAP recruitment, spindle organization, and mitotic progression. Loss of EML1 resulted in a reduction of taxol-stabilized microtubules, an increase in soluble tubulin, reduced α-tubulin acetylation, and enhanced vulnerability to nocodazole-induced microtubule depolymerization. These changes were accompanied by diminished recruitment of other MAPs such as EML4 and SEPTIN2 to microtubules, despite unchanged total protein levels. EML1 was found to be required for EML4's association with the microtubule network; its absence led to a significant reduction in EML4 binding, potentially contributing to impaired microtubule organization and mitotic fidelity. Notably, mitotic abnormalities such as spindle disorganization and prolonged division time were rescued by wild-type EML1 but not by the T243A mutant, which exhibited impaired microtubule binding and aggregation. Cell cycle-specific proteomic analysis revealed that EML1 associates with partially distinct sets of proteins during interphase and mitosis, indicating dynamic regulation of its interactome throughout the cell cycle. In addition, NEK9, a mitotic kinase not previously reported as an EML1 interactor, was reproducibly identified in Eml1-GFP pull-down samples, suggesting a potential new association. Importantly, EML1 regulates the dynamic localization of EML4 during cell division. In EML1 knockout cells, EML4 shows aberrant accumulation on spindle and midzone microtubules, whereas Eml1-GFP rescue restores its normal distribution. Overall, EML1 is established as a central scaffold-like regulator of microtubule stability, MAP interactions, and mitotic organization. Loss or mutation of EML1 compromises cytoskeletal integrity and mitotic fidelity, providing mechanistic insight into the pathogenesis of EML1-related heterotopia and suggesting potential targets for therapeutic intervention.Mikrotübüller ve mikrotübül ilişkili proteinler (MİP'ler), hücre içi taşınım, iğ ipliği oluşumu ve hücre bölünmesi gibi çeşitli hücresel süreçlerin düzenlenmesinde kritik rol oynar; bu süreçlerin tümü, düzgün beyin gelişimi ve kortikal organizasyonun sağlanması açısından hayati öneme sahiptir. Bu proteinler arasında yer alan EML1, subkortikal heterotopi ile ilişkilendirilmiştir; ancak mikrotübül organizasyonundaki moleküler rolü ve hastalıkla ilişkili mutasyonların yol açtığı sonuçlar hâlâ tam olarak anlaşılmamıştır. Bu çalışmada, EML1'in düzenleyici rolünü araştırmak amacıyla, HeLa hücrelerinde CRISPR-Cas9 ile oluşturulmuş knockout hücre hattı ve E14.5 günündeki fare ön beyin dokusundan elde edilen Eml1 koşullu knockout nöral progenitör hücreleri kullanılmıştır. GFP ile işaretlenmiş yabanıl tip veya hastalıkla ilişkili T243A mutasyonu taşıyan Eml1 proteinlerinin dıştan ekspresyonu, bu mutasyonun mikrotübül bağlanması ve hücresel fenotipler üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılmıştır. Mikrotübül stabilitesini, MİP'lerin mikrotübüllere bağlanmasını, iğ ipliği organizasyonunu ve mitoz ilerleyişini değerlendirmek amacıyla mikrotübül çöktürme deneyleri, konfokal immünofloresan görüntüleme, etiketsiz (label-free) kantitatif proteomik analizler ve canlı hücre görüntüleme yöntemlerinin bir kombinasyonu uygulanmıştır. EML1'in kaybı, taksol ile stabilize edilen mikrotübüllerde azalmaya, çözünür tübülin seviyelerinde artışa, α-tübülin asetilasyonunda azalmaya ve mikrotübül depolimerizasyonunu indükleyen nokodazol maddesine karşı hücrelerin artan duyarlılığına yol açmıştır. Bu değişimlere, EML4 ve SEPTIN2 gibi diğer MİP'lerin mikrotübüllere olan bağlanmalarının azalması eşlik etmiş, ancak bu proteinlerin toplam düzeylerinde bir değişiklik gözlenmemiştir. EML1'in, EML4'ün mikrotübül ağına bağlanması için gerekli olduğu gösterilmiş; EML1'in yokluğunda EML4'ün mikrotübüllere bağlanması anlamlı düzeyde azalmış ve bu durum, mikrotübül organizasyonu ve mitotik düzenin bozulmasına katkıda bulunmuş olabilir. Özellikle, mitotik iğ organizasyonundaki bozukluklar ve hücre bölünmesinin uzaması gibi mitotik kusurlar, yabanıl tip EML1 ile kurtarılmış; ancak mikrotübül bağlanması bozulmuş ve agregasyon gösteren T243A mutantı bu fenotipleri kurtaramamıştır. Hücre döngüsüne özel yapılan proteom analizleri, EML1'in interfaz ve mitoz fazlarında kısmen farklı protein kompleksleriyle etkileşime girdiğini ortaya koyarak, hücre döngüsü boyunca etkileşim ağının dinamik şekilde düzenlendiğini göstermiştir. Ayrıca, daha önce EML1 ile ilişkisi bildirilmemiş olan mitotik bir kinaz olan NEK9, Eml1-GFP pull-down örneklerinde tekrarlı olarak saptanmış ve bu durum olası yeni bir etkileşimi düşündürmektedir. Önemli olarak, EML1 hücre bölünmesi sırasında EML4'ün dinamik lokalizasyonunu düzenler. EML1 knockout hücrelerinde EML4, iğ iplikleri ve orta bölge mikrotübülleri üzerinde anormal birikim gösterirken, Eml1-GFP ile yapılan geri kazandırma normal dağılımını yeniden sağlar. Sonuç olarak, EML1, mikrotübül stabilitesi, MİP etkileşimleri ve mitotik organizasyonun merkezi bir düzenleyicisi olarak tanımlanmıştır. EML1'in kaybı veya mutasyonu, hücre iskeletinin bütünlüğünü ve mitotik doğruluğu bozmakta; bu durum, EML1 ile ilişkili heterotopinin patogenezine dair mekanistik bir bakış açısı sunmakta ve potansiyel tedavi hedeflerini işaret etmektedir.