The diagnostic role of next-generation sequencing on facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) and related phenotypes

Abstract

Facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) is the third most common genetic neuromuscular disorder exhibited by progressive muscle weakness, primarily affecting the face, scapular, and especially upper arm muscles. In approximately 95% of cases, classified as type 1 (FSHD1), the disease results from contractions of the D4Z4 macrosatellite repeats on chromosome 4q35. The remaining cases, classified as type 2 (FSHD2), are primarily caused by pathogenic variants in SMCHD1, with a smaller subset involving DNMT3B and LRIF1 genes. These variants not only lead to D4Z4 hypomethylation and aberrant DUX4 activation but may also influence the disease severity in FSHD1 patients with borderline D4Z4 repeat contractions. The diagnostic algorithm of FSHD involves the examination of D4Z4 Repeat Units (RU) and the analysis of the FSHD-associated genes to confirm or exclude diagnosis. The Molecular Combing (MC) technique has been a crucial tool for the precise and effective analysis of the D4Z4 region, while NGS provides a broader genetic landscape, specific to FSHD2 cases. This approach enables the identification of variants in SMCHD1, LRIF1, and DNMT3B, as well as the detection of variants in other neuromuscular disease-related genes. It enhances differential diagnosis, prevents misclassification, and improves the interpretation of genotype-phenotype correlations. A total of 96 unrelated patients' D4Z4 RUs were determined using MC. In this group, 82 patients had contracted D4Z4 RUs (67/82 with pathogenic 1–7 RUs and 15/82 with borderline 8–10 RUs). Of the remaining 14 patients, 12 presented with ≥11 RUs while in the remaining 2 cases, only the 4qB allele was detected. Twelve patients from this uncontracted group were selected for Whole Exome Sequencing (WES) analysis based on their disease severity and complex MC results. One unaffected and two affected relatives of one patient were included in this study group for segregation and confirmation purposes. Pathogenic variants in SMCHD1 were detected in three patients confirming the clinical diagnosis of FSHD. Pathogenic and/or likely pathogenic CAPN3 variants were identified in two patients, leading to a revised diagnosis of Limb-Girdle Muscular Dystrophy 2A (LGMD2A). In one patient, variant of unknown significance in FHL1 gene were identified. The results of this study largely align with the literature regarding the prevalence of contracted D4Z4 alleles in patients with a clinical diagnosis of FSHD and underscore the significance of NGS for ascertaining a definitive diagnosis in the small subset without contracted D4Z4 alleles. It is crucial to explore the impact of NGS to reveal overlapping genetic factors that may contribute to the clinical heterogeneity of FSHD and its differential diagnoses.

Fasiyoskapulohumeral müsküler distrofi (FSHD), yüz, omuz ve üst kol kaslarını etkileyen ilerleyici kas güçsüzlüğü ile karakterize, en sık görülen üçüncü genetik nöromusküler hastalıktır. FSHD tip 1 (FSHD1) olarak sınıflandırılan vakaların yaklaşık %95'inde hastalık, 4q35 kromozomu üzerindeki D4Z4 tekrar bölgesinin kısalmasından kaynaklanır. Geri kalan vakalar, FSHD tip 2 (FSHD2) olarak sınıflandırılır ve bunlar temel olarak SMCHD1 genindeki patojenik varyantlardan, daha küçük bir alt küme ise LRIF1 ve DNMT3B genindeki varyantlardan kaynaklanır. Bu varyantlar, sadece D4Z4 hipometilasyonuna ve anormal DUX4 aktivasyonuna yol açmakla kalmaz, aynı zamanda sınırda D4Z4 tekrar kısalması olan FSHD1 hastalarında fenotipi de etkileyebilir. FSHD'nin tanı algoritması, tanıyı doğrulamak veya dışlamak ve ayırıcı tanı gerektiren vakaları ayırt etmek için D4Z4 tekrar ünitesi analizini ve FSHD ile ilişkili genlerin analizini içerir. Moleküler taraklama (MT) tekniği, D4Z4 tekrar kısalmalarının hassas ve etkili analizi için kritik bir araç olmuştur. Öte yandan, NGS bu yaklaşımı tamamlayarak özellikle FSHD2 vakalarına özgü daha geniş bir genetik perspektif sunar. Bu yaklaşım, hastalık belirtilerini ve şiddetini etkileyebilecek SMCHD1, LRIF1 ve DNMT3B değişimlerinin yanı sıra nöromüsküler hastalık ilişkili diğer genlerdeki değişimlerin belirlenmesini sağlar. Bu, ayırıcı tanıyı geliştirir, yanlış sınıflandırmayı önler ve genotip-fenotip korelasyonlarının etkin yapılmasını sağlar. Bu çalışmada, 96 hastanın D4Z4 tekrar üniteleri MT tekniği ile belirlenmiştir. Bu grupta D4Z4 kısalması saptanmadığı veya sınırda tekrar sayısı görüldüğü için FSHD2 şüphesi olan 12 hastaya Tüm Ekzom Sekanslama uygulanmıştır. MT analizi, analiz edilen hastaların 82'sinde kısalmış D4Z4 4qA tekrar ünitesi (1–10 tekrar ünitesi), bunlardan 15'inde sınırda kısalma (8–10 tekrar ünitesi) tespit etmiştir. 12 hastada kısalma gözlenmezken, 2 hastada ise yalnızca 4qB tekrar alleli bulunduğu ortaya çıkmıştır. SMCHD1'deki patojenik varyantlar, sınırda gruptan iki hastada ve D4Z4 tekrar ünitesinde kısalma gözlenmeyen gruptan bir hastada olmak üzere üç hastada saptanmıştır. Ek olarak, iki hastada CAPN3 varyantları tespit edilmiş ve Limb-Girdle Müsküler Distrofi 2A (LGMD2A) tanısını düşündürmüştür. Geri kalan vakalarda genetik bulgular sonuçsuz olsa da 1 vakada FHL1 geninde bulunan belirsiz öneme sahip varyant dikkat çekmiştir. Bulgularımız, klinik FSHD tanısı almış hastalarda kısalmaya uğramış D4Z4 alellerinin yaygınlığı konusunda mevcut bilimsel çalışmalarla büyük ölçüde uyumludur. Bu durum, özellikle D4Z4 alellerinde kısalma görülmeyen küçük bir hasta grubunda kesin tanı için Yeni Nesil Dizileme (NGS) teknolojisinin ne kadar önemli olduğunu vurgulamaktadır. Dahası, NGS'nin FSHD'nin klinik olarak neden bu kadar farklı seyrettiğini (klinik heterojenite) ve FSHD'ye benzeyen diğer hastalıkları (ayırıcı tanı) anlamamıza yardımcı olabilecek örtüşen genetik faktörleri ortaya çıkarma potansiyelini araştırmanın kritik önem taşıdığını belirtmektedir.