Functional genetic screens of chromosome 1q in breast cancer via 2D and 3D in vitro models

Abstract

Breast cancer, with an incidence rate affecting approximately 2.3 million women globally, poses significant health challenges due to high recurrence rates and resistance to therapy. The diversity of molecular subtypes further complicates targeted treatment. Genetic abnormalities, particularly chromosomal alterations, play a critical role in tumour initiation and progression. Specifically, chromosome 1q (Chr1q) copy number alterations (CNA) are linked to poor patient prognosis and survival. This study hypotheses that Chr1q CNAs induce a genomic disorder/catastrophe, activating oncogenic drivers or causing gene expression loss. To investigate, we performed functional CRISPR screening targeting Chr1q genes in breast cancer. We utilised both 2D and 3D cultures in two breast cancer cell lines and one normal breast cell line to capture cancer-specific phenotypes influencing proliferation. We identified cancer-specific dropout genes negatively impacting proliferation in breast cancer cells but not in non-tumorigenic controls. Among 14 shared candidates, RPRD2 and GON4L were selected for further validation due to their significant effects on breast cancer proliferation in both 2D and 3D models. RPRD2 showed cancer-specific activity, while GON4L also impacted normal breast cells. For enriched candidates with positive phenotypes, we normalised 3D screening results by 2D (3D/2D). ARL8A and ARNT emerged as significant in at least one breast cancer cell line. Validation experiments revealed that blocking ARL8A and ARNT decreased proliferation in 2D models but increased 3D spheroid growth, indicating differential phenotypic impacts. Additionally, ARNT knockout in normal breast cells led to increased proliferation. This study highlights the necessity of transitioning from 2D to 3D models in functional screening for more accurate phenotypic evaluations. It also underscores the importance of Chr1q in breast cancer carcinogenesis and identifies potential cancer driver genes.

Meme kanseri, dünya genelinde yaklaşık 2.3 milyon kadını etkileyen bir kanser türü olup yüksek nüks oranları ile ilerleyen safhalarda tedaviye direnç, meme kanserinin düşük sağkalım oranları ile ilişkilendirilmektedir. Moleküler alt tiplerin çeşitliliği, hedefe yönelik tedaviyi oldukça olumsuz yönde etkilemektedir. Genetik anormallikler, özellikle kromozomal değişiklikler, kanser oluşumunda ve ilerlemesinde kritik bir rol oynamaktadır. Özellikle kromozom 1q kopya sayısı değişiklikleri hastalığın kötü prognozu ve hasta sağkalımı ile ilişkilidir. Bu çalışma kapsamında, kromozom 1q kopya sayısı değişikliklerinden dolayı meydana gelen genomik düzensizliklerin onkojenik genlerin aktivasyonu veya gen ekspresyonlarında kayba sebep olabileceği öngörülmektedir. Bu nedenle, aday genlerin belirlenebilmesi için meme kanseri hücre hatlarında Chr1q genlerini hedef alan fonksiyonel CRISPR taramaları gerçekleştirilmiştir. İki meme kanseri hücre hattı ve bir normal meme hücre hattında hem 2-boyutlu (2D) hem de 3-boyutlu (3D) modeller kullanılarak proliferasyonu etkileyen kansere özgü fenotiplerin belirlenebilmesi amaçlanmıştır. Meme kanseri hücrelerinde proliferasyonu olumsuz etkileyen, ancak normal hücre kontrollerinde etkisi olmayan kansere özgü hedef genler belirlenmiştir. 14 ortak gen arasında, RPRD2 ve GON4L hem 2D hem de 3D modellerde meme kanseri proliferasyonuna önemli etkileri nedeniyle aday genler olarak belirlenmiştir. Aday genlerin susturulması ile meme kanseri hücre hatlarında proliferasyonun düştüğü gözlemlenmiştir. RPRD2 kansere özgü aktivite gösterirken, GON4L geninin hedeflendiği normal meme hücrelerinde de proliferasyonun etkilendiği gözlemlenmiştir. Pozitif fenotiplerin belirlenebilmesi için 3D tarama sonuçları, 2D sonuçlar ile normalize edilmiş ve ARL8A ve ARNT genleri aday genler olarak belirlenmiştir. Doğrulama deneyleri sonucunda, ARL8A ve ARNT genlerinin baskılanmasının 2D modellerde proliferasyonu azalttığı; ancak 3D sferoid büyümesini artırdığı bulgulanmıştır. Normal meme hücrelerinde ARNT susturulması ile proliferasyonun arttığı gözlenmiştir. Bu çalışma, daha doğru fenotipik değerlendirmeler için CRISPR'a dayalı fonksiyonel taramalarda 2D modellerden 3D modellere geçişin gerekliliğini vurgulamaktadır. Ayrıca, kromozom 1q'nun meme kanserindeki rolünü ve bu kromozom üzerinde bulunabilecek potansiyel kanser sürücü genleri tanımlamaktadır.