The role of p53 and p21 in cell density dependent cisplatin resistance in ovarian cancer cells

Abstract

Chemoresistance is one of the major challenges in ovarian cancer. Resistant cancer cells which lead to disease relapse are the most prominent causes of death in ovarian cancer patents. Cisplatin is one of the most common platinum-based chemotherapeutic agents used to treat ovarian cancer. It's main mechanism of action involves inhibiting transcription by covalently binding to DNA, forming adducts which cause DNA damage and resulting in cell death. Tumor suppressor p53 exhibits great importance in determining whether the cells will go into apoptosis or repair DNA damage upon exposure to cisplatin. Associated with p53 is p21, a cyclin dependent kinase inhibitor (CDK) that is directly responsible for cell cycle arrest and cellular repair at the G1/S and G2/ phases of the cell cycle. Despite that the use of cisplatin increased effectiveness of chemotherapy in ovarian cancer, resistance to cisplatin is a major handicap in the clinic. Recent studies have suggested a new mode of cisplatin resistance in ovarian cancer cells, which is cell density-dependent cisplatin resistance at which ovarian cancer cells exhibit increased resistance to cisplatin as the cell density in cancer cell populations increase. Although cell density-dependent cisplatin resistance may have important clinical implications, its underlying mechanisms are not clear. To understand how cellular density affects cisplatin resistance in ovarian cancer, in this thesis we investigated the responses of sensitive (A2780) and resistant (CP16) ovarian cancer cell lines to cisplatin at low, confluent, and overconfluent culture conditions. In order to evaluate the contribution of p53 and p21's functions in cell density dependent chemoresistance we assessed the differential protein expression of p53 and p21 along with their phosphorylated forms at different subcellular fractions. Hence, we aimed to shed light on possible mechanisms of cisplatin resistance at increasing confluence levels. Moreover, we investigated the changes in the influx and efflux pumps that determine intracellular cisplatin accumulation to understand whether the degree of cell – cell interaction at different confluency levels affects the cells' cisplatin uptake or efflux capabilities. Our study suggests that p53 and p21 are regulated in a cell density dependent manner in response to cisplatin, including changes in their phosphorylation and subcellular localization. In CP16 cells, the confluence dependent pattern of p53 and p21 regulation seem to support cisplatin resistance at higher cell densities, while in A2780, the opposite pattern is observed

Kemorezistans, over (yumurtalık) kanserinde karşılaşılan en büyük zorluklardan biridir. Hastalığın nüksüne neden olan dirençli kanser hücreleri, over kanseri hastalarında en yaygın ölüm nedenleri arasında yer almaktadır. Sisplatin, over kanserinin tedavisinde en yaygın kullanılan platin bazlı kemoterapötik ajanlardan biridir. Ana etki mekanizması, DNA'ya kovalent olarak bağlanarak adductlar (bağlantılar) oluşturması, bu yolla DNA hasarına neden olması ve transkripsiyonu engelleyerek hücre ölümüne yol açmasıdır. Tümör baskılayıcı p53, hücrelerin sisplatin maruziyeti sonrası apoptoza mı gideceği yoksa DNA hasarını mı onaracağı kararında önemli bir rol oynar. p53 ile ilişkili olarak görev yapan p21, hücre döngüsünü G1/S ve G2/M evrelerinde durdurarak hücresel onarımdan sorumlu olan bir siklin-bağımlı kinaz inhibitörüdür (CDK inhibitörü). Sisplatinin kullanımı over kanserinde kemoterapinin etkinliğini arttırsa da, sisplatine direnç klinikte önemli bir zorluktur. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, over kanseri hücrelerinde yeni bir sisplatin direnç tipi tanımlamıştır. Hücre yoğunluğuna bağlı sisplatin direnci olarak tanımlanan bu direnç tipinde, kanser hücre popülasyonunda hücrelerin yoğunlukları arttıkça, sisplatine direnç artmaktadır. Bu direnç tipi önemli klinik sonuçları olabilecek bir direnç tipi olsa da, hücre yoğunluğu bağımlı sisplatin direncinin altında yatan mekanizmalar henüz net olarak bilinmemektedir. Over kanserinde hücre yoğunluğunun sisplatin direncini nasıl etkilediğini anlayabilmek için, bu tez çalışmasında sisplatine duyarlı (A2780) ve dirençli (CP16) over kanseri hücre hatlarının sisplatine verdikleri yanıtlar, düşük, tam ve aşırı konfluent hücre kültürü koşullarında incelenmiştir. p53 ve p21'in hücre yoğunluğuna bağımlı kemorezistans üzerindeki katkılarını anlayabilmek amacıyla, bu proteinlerin ve fosforile formlarının farklı hücre alt fraksiyonlarındaki ekspresyon seviyeleri analiz edilmiştir. Bu şekilde, artan hücre yoğunluğu seviyelerinde sisplatin direncinin olası mekanizmalarını aydınlatmak hedeflenmiştir. Ayrıca, farklı yoğunluk seviyelerindeki hücre – hücre etkileşim derecesinin hücrelerin sisplatin alımı veya atılım kapasitelerini etkileyip etkilemediğini anlamak için hücre içi sisplatin birikimini belirleyen içeri alım ya da dışa atım pompalarındaki değişiklikler de incelenmiştir. Çalışmamız, p53 ve p21'in sisplatine yanıt olarak hücre yoğunluğuna bağlı şekilde düzenlendiğini; bu bağlamda fosforilasyon durumlarında ve hücresel lokalizasyonlarında değişiklikler olduğunu göstermektedir. CP16 hücrelerinde gözlemlenen hücre yoğunluğu bağımlı p53 ve p21 düzenlenme paterni, yüksek hücre yoğunluğunda gözlenen sisplatin direncini açıklarken; A2780 hücrelerinde bunun tersi bir patern görülmektedir.