Adaptive response to fluconazole in candida parasilosis : ergosterol pathway mutations, gene expressions and metabolic shifts

Abstract

Candida parapsilosis complex is the second most common cause of bloodstream infection among Candida species both in our country and in many centers in Southern Europe and become a major health-care problem due to the increasing antifungal resistance. Azoles, an important group of antifungal drugs are bind to lanosterol demethylase and inhibit the enzyme. Resistance is usually associated with point mutations in the ERG11 gene and ERG3 genes which play role in ergosterol biosynthesis. This study aims to analyze the effects of fluconazole on C. parapsilosis cells in metabolomic, transcriptomic and genomic level especially focusing on the critical steps in ergosterol synthesis pathway. In this study, 15 fluconazole non-susceptible C. parapsilosis isolates are included. Analysis of the resistance profile is performed with broth microdilution test according to Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) guidelines. Fluconazole non-susceptible isolates are treated with the 0.5 Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and 1 MIC of fluconazole and the mRNA expression level changes are measured with quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) method. Effects of fluconazole on the metabolomic profiles of C. parapsilosis cells are examined with Nucleic Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR). Sanger sequence analysis showed that 10/15 (66%) of the isolates were harboring Y132F mutations in ERG11 gene and all of them were carrying missense mutation (C825T) in ERG3 gene. Although, an increase in ERG11 mRNA expression levels is observed regardless of the mutation type, some of the selected isolates behaved controversial under fluconazole exposure. Together with all isolates, especially K478 had a decreasing ERG11 mRNA expression level trend under higher fluconazole concentration. Even if the highest ERG3 and UPC2 mRNA expression levels were observed in K478, the same decreasing trend were also detected under higher fluconazole concentrations in these genes. According to metabolomic analysis results, under the fluconazole exposure, the metabolic pathways most significantly altered are: 1) alanine, aspartate, and glutamate metabolism, 2) arginine and proline metabolism, 3) homocysteine, methionine metabolism, and 4) arabinitol metabolism. We assumed that the metabolomic changes observed in our study might be related with two important biochemical processes which are nitrogen assimilation and oxidative stress responses. In conclusion, in drug-resistant C. parapsilosis isolates, the response to fluconazole exposure in terms of mRNA expression of ergosterol biosynthesis enzyme genes is strain-specific, clearly indicating that there are numerous different regulations besides point mutations in the enzyme genes of ergosterol synthesis and control. These regulations lead to a wide range of metabolomic changes within the cell, while a common metabolic response is formed in almost all isolates to neutralize the toxic effect of fluconazole and ensure survival. A detailed in-depth investigation of this survival response will uncover new drug targets in the future.Candida parapsilosis kompleks, ülkemizde ve Güney Avrupa'daki birçok merkezde Candida türleri arasında kan dolaşımı enfeksiyonunun ikinci en sık nedeni olup, antifungal direncin artması nedeniyle önemli bir sağlık sorunu haline gelmektedir. Antifungal ilaçların önemli bir grubu olan azoller, lanosterol demetilaza bağlanarak bu enzimi inhibe ederler. Azol direnci, genellikle ergosterol biyosentezinde rol oynayan ERG11 ve ERG3 genlerindeki nokta mutasyonlarla ilişkilidir. Bu çalışmanın amacı flukonazolün C. parapsilosis izolatları üzerindeki etkilerini metabolomik, transkriptomik ve genomik düzeyde incelemektir. Bu çalışmaya 15 flukonazol dirençli C. parapsilosis izolatı dahil edilmiştir. Direnç profilinin analizi, Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) kılavuzlarına göre sıvı mikrodilüsyon testiyle gerçekleştirilmiştir. Flukonazole duyarlı olmayan izolatlar, flukonazolün 0.5 Minimum İnhibitör Konsantrasyonu (MIK) ve 1 MIK konsantrasyonuna maruz bırakılarak mRNA ekspresyon seviyesi değişiklikleri, kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile ölçülmüştür. Flukonazolün C. parapsilosis hücrelerinin metabolomik profilleri üzerindeki etkileri Nükleik Manyetik Rezonans Spektroskopisi (NMR) ile incelenmiştir. Sanger dizi analizi sonuçları izolatların 10/15'inin (%66) ERG11 geninde Y132F mutasyonu taşıdığını ve hepsinin ERG3 geninde bir "missense" mutasyon (C825T) taşıdığını göstermiştir. Mutasyon tipine bakılmaksızın ERG11 mRNA ekspresyonunda bir artış gözlenmesine rağmen, seçilen izolatlardan bazıları flukonazol maruziyeti altında farklı davranışlar sergilemiştir. Tüm izolatlarda, özellikle K478'de, yüksek flukonazol konsantrasyonu altında ERG11 mRNA ekspresyonunda azalma eğilimi gözlenmiştir. En yüksek ERG3 ve UPC2 mRNA ekspresyon seviyeleri K478'de gözlenmiş olsa da, azalma eğilimi bu genlerdeki yüksek flukonazol konsantrasyonlarında da tespit edilmiştir. Metabolomik analiz sonuçlarına göre, flukonazol maruziyeti altında en belirgin şekilde değişen metabolik yollar 1) alanin, aspartat ve glutamat metabolizması, 2) arginin ve prolin metabolizması, 3) homosistein, metionin metabolizması ve 4) arabinitol metabolizmasıdır. Çalışmamızda gözlenen bu metabolomik değişikliklerin, nitrojen asimilasyonu ve oksidatif stres tepkileri olan iki önemli biyokimyasal süreçle ilişkili olduğu düşünülmektedir. Sonuç olarak, ilaca dirençli C. parapsilosis izolatlarında, ergosterol biyosentezi ile ilişkili enzim genlerinin mRNA ekspresyonu açısından flukonazol maruziyetine verilen yanıt suşa özgüdür. Bu durum, ergosterol sentezi yolağı ve kontrolü ile ilişkili enzimleri kodlayan genlerindeki nokta mutasyonlarının yanı sıra, farklı hücre içi düzenlemelerin olduğunu göstermektedir. Bu düzenlemeler hücre içinde çok çeşitli metabolomik değişikliklere yol açarken, hemen hemen tüm izolatlarda flukonazolün toksik etkisini nötralize etmek ve hayatta kalmayı sağlamak için ortak bir metabolik yanıt oluştuğu gözlenmektedir. Bu hayatta kalma stratejisinin ayrıntılı ve derinlemesine araştırılması, gelecekte yeni ilaç hedeflerini ortaya çıkarılmasına katkı sunacaktır.