Investigating ICI-inducedd thyroid dysfunction: initial immune dysregulation insights and 3D co-culture model with nthy-Ori 3-1 and PBMCs

Abstract

Immune checkpoint inhibitors (ICIs) have revolutionized cancer treatment, significantly improving survival rates across a range of malignancies by reinforcing T cells' ability to recognize and eradicate cancer cells. Despite their effectiveness, ICIs are frequently associated with immune-related adverse events (irAEs), the most prevalent of which is thyroid dysfunction (TD). Rarely, these toxicities may be severe enough to cause therapy to be postponed or terminated. Understanding the mechanisms underlying thyroid irAEs could provide valuable insights into both thyroid autoimmune diseases and the broader spectrum of irAEs linked to ICIs. This study addresses gaps in current research by immunophenotyping patients undergoing ICI therapy at two critical time points: before treatment and three weeks post-treatment. Comparative analyses were performed against control groups of healthy individuals and patients with Hashimoto's thyroiditis. Among the 9 patients studied, 2 developed TD within three weeks of PD-1 inhibitor treatment. Flow cytometry revealed significant increases in IFN-γ producing CTLs and NK cells, along with TNF-α producing B cells and its expression levels in NKT-like cells following the therapy (p<0.05). Notably, the increase in TNF-α producing B cells was more pronounced when compared to all study groups. These findings suggest that immune cell activation and subsequent cytokine production, aimed at combating tumor cells, may also serve as predictive biomarkers for irAEs, including ICI-induced TD. To improve the physiological relevance of in vitro studies, this research also introduces a novel 3D co-culture model using thyroid spheroids derived from the Nthy-Ori 3-1 cell line, co-cultured with patient-specific PBMCs. Initial results indicated no significant differences in thyroid cell viability between TD patients and controls in the 3D setting, contrasting with notable viability reductions in 2D co-cultures. Additionally, immunophenotyping performed on 3D co-cultures revealed a substantial increase in B cell populations of the patients on the third week of therapy compared to healthy controls (p=0.0500). The findings from both immunophenotyping and in vitro research deepen our understanding of conditions where the pathophysiology is poorly defined, as in the case of ICI-induced TD. Despite limitations related to the allogeneic nature of the approach, this study is pioneering in creating an in vitro model specifically designed to investigate ICI-related irAEs. It offers preliminary insights and establishes a methodological framework for future thyroid research.İmmün kontrol-noktası inhibitörleri (ICIs), T hücrelerinin kanser hücrelerini tanıma ve yok etme yeteneğini güçlendirerek, çeşitli kanserlere karşın hayatta kalma oranlarını önemli ölçüde artırmış ve kanser tedavisinde devrim yaratmıştır. Ancak, ICI'lerin etkinliğine rağmen, sıklıkla bağışıklıkla ilişkili yan etki olaylar (irAEs) ile ilişkilendirilirler; bunlar arasında en yaygın olanı tiroid disfonksiyonudur (TD). Nadir durumlarda, bu toksisiteler tedavinin ertelenmesine veya sonlandırılmasına neden olacak kadar şiddetli olabilir. Tiroid irAEs'nin altında yatan mekanizmaların anlaşılması, hem tiroid otoimmün hastalıkları hem de ICIs ile ilişkili irAEs'in daha geniş spektrumu hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Bu çalışma, ICI tedavisi gören hastaların tedavi öncesi ve tedaviden üç hafta sonrası olmak üzere iki kritik zaman noktasında immünofenotiplendirilmesiyle mevcut araştırmalardaki boşlukları ele almaktadır. Sağlıklı bireyler ve Hashimoto tiroiditi olan hastalardan oluşan kontrol gruplarıyla karşılaştırmalı analizler yapılmıştır. İncelenen 9 hastadan 2'si PD-1 inhibitörü tedavisinden üç hafta içinde TD geliştirmiştir. Akış sitometrisi, tedaviyi takiben IFN-γ üreten CTL'ler ve NK hücrelerinde, ayrıca B ve NKT-benzeri hücrelerde TNF-α ekspresyon seviyelerinde önemli artışlar olduğunu ortaya koymuştur (p< 0.05). Özellikle, TNF-α üreten B hücrelerindeki artış, tüm çalışma gruplarına kıyasla daha belirgindi. Bu bulgular, tümör hücreleriyle savaşmayı amaçlayan immün hücre aktivasyonu ve bunun sonucunda oluşan sitokin üretiminin, ICI kaynaklı TD'da dahil olmak üzere irAEs için öngören biyobelirteçler olarak da hizmet edebileceğini düşündürmektedir. In-vitro çalışmaların fizyolojik geçerliliğini artırmak için bu araştırma, hastaya özgü PBMC'lerle birlikte Nthy-Ori 3-1 hücre hattından türetilen tiroid sferoidlerini kullanarak yeni bir 3D ortak kültür modeli de önermektir. İlk sonuçlar, 3D ortamda TD hastaları ile kontroller arasında tiroid hücresi canlılığı açısından anlamlı bir fark olmadığını, ancak 2D ortak kültürlerde belirgin canlılık azalması gözlemlendi. Ayrıca, 3D ortak kültürlerde sferoidlerde oluşan inflitre hücre immünofenotiplendirmesinde, tedavinin üçüncü haftasında hastaların B hücre popülasyonlarında sağlıklı kontrollere kıyasla önemli bir artış göstermiştir (p=0.05). Hem immünofenotiplendirme hem de in-vitro araştırmalardan elde edilen bulgular, ICI kaynaklı TD vakasında olduğu gibi patofizyolojinin zayıf bir şekilde tanımlandığı durumlar hakkındaki anlayışımızı derinleştirirmeye yardımcı olur . Allojenik yaklaşımın doğasına ilişkin sınırlamalara rağmen, bu çalışma, özellikle ICI ile ilişkili irAEs'i araştırmak için tasarlanmış bir in vitro model oluşturma konusunda öncü niteliktedir. Ön bilgi sunmakta ve gelecekteki tiroid araştırmaları için metodolojik bir çerçeve oluşturmaktadır.