Molecular analysis of cortical malformation in mammalian cortex by using proteomics approaches

Abstract

The layered structure of the cerebral cortex is formed through a complicated sequence of highly controlled stages during corticogenesis. During this process, the perturbation of neuronal migration and cell division can result in a rare disorder called cortical heterotopia. Heterotopia patients can have recurrent epileptic seizures, developmental delays, and mild intellectual disabilities. Heterotopia has been challenging to study because human mutations associated with the disease often fail to form heterotopia in mouse models. Eml1 is a heterotopia-associated gene where the perturbations cause heterotopia formation in humans and mice. During my Ph.D., I focused on the investigation of the functional role of EML1 in heterotopia formation through comprehensive cellular and biochemical analysis, including imaging, BioID proximity labeling, proteomic profiling via label-free proteomics or dimethyl labeling, phosphoproteomics, and microtubule-pelleting assays. In the first part of my thesis, I showed that heterotopia-associated mutant EML1 reduces the protein-microtubule binding affinity. BioID proximity labeling of wild-type and mutant EML1 revealed that EML1 interacts with many microtubule and cytoskeletal organization proteins, most of which are lost in mutant-expressing cells. Thus, the wild-type protein interactome is impacted by a heterotopia-causing mutation. This work identified several novel interactors, along with known interaction partners of EML1. Proteome profiling in cortices and primary neuronal cells in a conditional Eml1 knockout (cKO) mouse versus control showed dysregulations in microtubule organization and protein metabolic processes upon Eml1 depletion. These large-scale proteomic analyses are essential for studying the underlying mechanism in brain development and heterotopia formation. In the second part of my thesis, I present my contributions to the published article, which focuses on the cell cycle-dependent regulation of an adhesion protein, protocadherin-7. In this project, as my side project, I unveiled the spatiotemporal regulation of the protein and its' palmitoylation-dependent regulation in cell division.

Serebral korteksin katmanlı yapısı, kortikogenez sırasında yüksek düzeyde kontrol edilen aşamaların karmaşık bir dizisi yoluyla oluşmaktadır. Bu süreç sırasında nöronal göç ve hücre bölünmesindeki bozulma, kortikal heterotopi adı verilen nadir bir bozukluğa yol açabilmektedir. Heterotopi hastalarında tekrarlayan epileptik nöbetler, gelişimsel gecikmeler ve hafif zihinsel engeller olabilmektedir. Heterotopi hastalığının araştırılması oldukça zordur çünkü hastalıkla ilişkili insan mutasyonları fare modellerinde sıklıkla heterotopya oluşturmada başarısız olmaktadır. Eml1, insanlarda ve farelerde düzensizliklerin heterotopya oluşumuna neden olan heterotopya ile ilişkili bir gendir. Doktora eğitimim sırasında, EML1'in heterotopi oluşumundaki işlevsel rolünün, görüntüleme, BioID yakınlık etiketlemesi, etiketsiz proteomik veya dimetil etiketleme yoluyla proteomik profilleme, fosfoproteomikler ve mikrotübül peletleme deneyleri ile gösterdim. Tezimin ilk bölümünde heterotopya ilişkili mutant EML1'in protein-mikrotübül bağlanma afinitesini azalttığını gösterdim. Yabani tip ve mutant EML1'in BioID yakınlık etiketlemesi, EML1'in çoğu mutant eksprese eden hücrelerde kaybolan birçok mikrotübül ve hücre iskeleti organizasyon proteini ile etkileşime girdiğini ortaya çıkardı. Bu nedenle, vahşi tip protein interaktomu, heterotopiye neden olan bir mutasyondan etkilenmektedir. Bu çalışma, EML1'in bilinen etkileşim ortaklarının yanı sıra birkaç yeni etkileşimciyi tanımladı. Koşullu Eml1 nakavt (cKO) faresinde kortekslerde ve birincil nöron hücrelerinde proteom profili, kontrole göre Eml1 susturulmuş hücrelerde mikrotübül organizasyonunda ve protein metabolik süreçlerinde düzensizlikler gösterdi. Bu büyük ölçekli proteomik analizler, beyin gelişimi ve heterotopi oluşumunun altında yatan mekanizmayı incelemek için gereklidir. Tezimin ikinci bölümünde, bir adezyon proteini olan protocadherin-7'nin hücre döngüsüne bağlı düzenlenmesini konu alan yayınlanmış makaleye katkılarımı sunuyorum. Bu projede yan projem olarak proteinin uzay-zamansal düzenlemesini ve hücre bölünmesindeki palmitoilasyona bağlı düzenlemeyi ortaya çıkardım.