Evaluation of targeted delivery of specific antisense oligonucleotides via engineered exosomes to combat COVID-19 disease using human airway epitheal cell cultures

Abstract

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) has caused significant morbidity and mortality worldwide. The disease is associated with increased inflammatory status that may lead to pneumonia, cytokine storm, and acute respiratory distress syndrome (ARDS). Cytokine storm, a severe immune reaction characterized by the overproduction of inflammatory cytokines, has been identified as a critical factor in the progression of severe COVID-19 cases. The rapid global spread of SARS-CoV-2 has driven an urgent need for innovative therapeutic approaches. Our study aimed to develop and evaluate engineered exosome-based delivery systems for antiviral antisense oligonucleotides (ASOs) targeting COVID-19. The exosomes, which were engineered to target angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor, the main receptor for viral entry, were produced by expressing the receptor-binding domain (RBD) of the SARS-CoV-2 spike (S) protein on their surface. The exosomes were loaded with specifically designed ASOs to target key viral and cytokine genes. These exosomes were then administered concurrently to Calu-3 human airway epithelial cell line, and primary human bronchial epithelial cells (HBECs) exposed to SARS-CoV-2 for 24 hours. Following the experiments, laboratory analyses such as quantitative PCR, Western blotting, immunofluorescence, and ELISA were performed on the treated cells and their extracted biomolecules. Our study findings demonstrated a significant decrease in viral replication, and a reduction in inflammatory markers in SARS-CoV-2-infected airway epithelial cells. Specifically, the viral antisense locked nucleic acid (LNA)-loaded exosomes decreased the expression of the SARS-CoV-2 nucleocapsid (N1) gene (p< 0.001) in infected airway epithelial cells. Additionally, the cytokine antisense LNA-loaded exosomes reduced key inflammatory mediators including NF-κB (p < 0.05), NLRP3 (p < 0.01), TNF-α (p < 0.01), IL-6 (p < 0.01), and IL-8 (p < 0.05), as compared to positive control group. Despite partially transfection of cells with LNA loaded exosomes, the targeted delivery of ASOs showed decreased viral load and cytokine storm related gene expression. These results demonstrate the potential of exosome-mediated anti-sense oligonucleotide (ASO) delivery as a promising therapeutic strategy against COVID-19. This approach also offers a new avenue to combat the disease by reducing viral replication and inflammatory responses.

Koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19), dünya genelinde önemli morbidite ve mortaliteye neden olmuştur. Hastalık, pnömoni, sitokin fırtınası ve akut solunum sıkıntısı sendromuna (ARDS) yol açabilen artmış inflamatuar durum ile ilişkilidir. İnflamatuar sitokinlerin aşırı üretimi ile karakterize edilen şiddetli bir immün tepki olan sitokin fırtınası, ciddi COVID-19 vakalarının ilerlemesinde kritik bir faktör olarak tanımlanmıştır. SARS-CoV-2'nin küresel çapta hızla yayılması, yenilikçi terapötik yaklaşımlar için acil bir ihtiyaç doğurmuştur. Çalışmamızda, COVID-19'u hedefleyen antiviral antisens oligonükleotidlerin (ASO'lar) taşınması için mühendislik ürünü eksozom bazlı taşıma sistemlerinin geliştirilmesi ve değerlendirilmesini amaçladık. Viral giriş için ana reseptör olan anjiyotensin dönüştürücü enzim 2'yi (ACE2) hedeflemek üzere tasarlanan eksozomlar, yüzeylerinde SARS-CoV-2 spike (S) proteininin reseptör bağlanma bölgesinin (RBD) eksprese edilmesiyle üretildi. Eksozomlar, anahtar viral ve sitokin genlerini hedeflemek için özel olarak tasarlanmış ASO'larla yüklendi. Bu eksozomlar daha sonra SARS-CoV-2'ye 24 saat maruz bırakılan Calu-3 insan hava yolu epitel hücre hattı ve primer insan bronş epitel hücrelerine (HBEC'ler) eşzamanlı olarak uygulandı. Deneylerin ardından, tedavi edilen hücreler ve bunlardan ekstrakte edilen biyomoleküller üzerinde kantitatif PCR, Western blot, immünofloresan ve ELISA gibi laboratuvar analizleri yapıldı. Çalışmamızın bulguları, SARS-CoV-2 ile enfekte olmuş hava yolu epitel hücrelerinde viral replikasyonda önemli bir azalma ve inflamatuar belirteçlerde belirgin bir azalma gösterdi. Özellikle, viral antisens kilitli nükleik asit (LNA) yüklü eksozomlar, enfekte hava yolu epitel hücrelerinde SARS-CoV-2 nükleokapsid (N1) geninin ekspresyonunu azalttı (p < 0.01). Ayrıca, sitokin antisens LNA yüklü eksozomlar, pozitif kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, NF-κB (p < 0,05), NLRP3 (p < 0,01), TNF-α (p < 0,01), IL-6 (p < 0,01) ve IL-8 (p < 0,05) dahil olmak üzere önemli inflamatuar mediyatörlerde azalma sağlamıştır. Hücrelerin LNA yüklü eksozomlarla kısmi transfeksiyonuna rağmen, ASO'ların hedeflenmiş iletimi, viral yükte ve sitokin fırtınası ile ilişkili gen ekspresyonunda azalma göstermiştir. Bu sonuçlar, eksozom aracılı ASO iletiminin COVID-19'a karşı umut verici bir terapötik strateji olma potansiyelini ortaya koymaktadır. Bu yaklaşım ayrıca viral replikasyonu ve inflamatuar yanıtları azaltarak hastalıkla mücadelede yeni bir bakış sunmaktadır.