The effect of depleting the CNS border associated macrophages at pre-symptomatic stage pf ALS on neuroinflammation, symptoms and survival

Abstract

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is an incurable motor neuron disease characterized by progressive muscle atrophy, including respiratory muscles. Muscle weakness, wasting, cramps, and fasciculations result from the loss of lower motor neurons. Additionally, patients with ALS may experience extra-motor symptoms due to neuronal loss in the frontotemporal cortex. Survival typically ranges from 2 to 4 years after disease onset, with respiratory failure being the primary cause of death. ALS, the most common motor neuron disease in adults, has an incidence of 2 per 100,000 and a prevalence of 5.4 per 100,000. Despite extensive studies on ALS pathogenesis, the exact mechanism of neurodegeneration remains unclear. Perivascular macrophages (PVMs) are myeloid cells residing in the central nervous system (CNS) and are part of the larger group of macrophages known as CNS border-associated macrophages. In a healthy state, these cells phagocytize harmful substances that infiltrate from the vasculature and regulate immune responses. However, in an inflammatory state, they contribute to increased vascular permeability and subsequent neuroinflammation. Dysregulation of the blood-brain barrier (BBB) occurs well before the symptomatic stage of ALS and influences PVMs, leading to increased reactive oxygen species (ROS) generation and BBB permeability. Transformed PVMs, in collaboration with other brain myeloid cells, initiate proinflammatory processes. Aim: Our aim is to investigate the contribution of PVMs to ALS pathogenesis and their impact on neuroinflammation. To achieve this, we depleted PVMs at the presymptomatic stage of ALS and evaluated microglia activation, astrogliosis, BBB disruption, symptoms, and lifespan in an animal model. Methods: PVM depletion was achieved by injecting clodronate-loaded liposomes or PBS-loaded liposomes (as a control) into the cisterna magna of SOD1(G93A) mutated rats, an ALS animal model. The study included 59 SOD1 mutated rats (both male and female). Preliminary studies involved nine rats, while the remaining fifty rats received either clodronate-loaded liposomes (depleted group) or PBS-loaded liposomes (sham group) via cisternal injection. The clodronate concentration in the suspension was 5 mg/ml. Rats were divided into three experiments: early single injection (day 80 after birth), late single injection (day 160 after birth), and multiple injections (administered at day 80 after birth followed by two additional injections every 20 days). Rats were monitored until reaching the humane endpoint, when the rats cannot turn back after being placed on their side, with weight measured twice a week and locomotor activity tested weekly to assess neuromuscular strength, motor coordination, and balance. The locomotor activity test comprised gait analysis, tail elevation, balance beam test, paw-grip endurance, extension reflex, rearing behavior, and ladder rung test for paw placement accuracy during walking. Validation studies included wild-type (WT) rats from a Sprague Dawley background for comparison of PVMs between SOD1 and WT rats, injection point validation, and confirmation of PVM depletion. FITC-Albumin injection into the cisterna magna of two WT rats confirmed appropriate delivery to the brain and spinal cord. Immunofluorescent staining of astrocytes, microglia, and CD206+ cells in obtained tissues from sacrificed animal models was conducted using GFAP, Iba 1, and CD206 primary antibodies, respectively. Statistical methods were employed to analyze behavior scoring and weight change, as well as staining results, between depleted and sham groups in the three experiments. Results: Preliminary studies on CNS tissues from SOD1 and WT rats revealed upregulation of CD206+ cells in various brain and spinal cord regions of SOD1 mutated rats. FITC-Albumin injection confirmed delivery to the brain and spinal cord, colocalizing with PVMs, validating the injection point for subsequent studies. Immunofluorescence staining with CD206 for brain and spinal cord sections of WT rats showed downregulation of CD206+ cells in all regions of the depleted group, with significant results for the spinal cord in the multiple injection experiment. Weight change analysis indicated a delayed presymptomatic stage in the depleted group across all three experiments, with significant results for the multiple injection experiment. Behavioral studies confirmed milder or delayed symptomatic stages in the depleted groups, particularly in the multiple injection experiment. Immunofluorescence staining for PVMs, astrocytes, and microglia revealed upregulation of all three cell types in the ventral horn of the lumbar section of the spinal cord in the depleted group compared to the sham group in both the late single injection and multiple injection experiments. Conclusion: This study demonstrated that depleting perivascular macrophages at the presymptomatic stage of ALS can delay disease onset, particularly in animals receiving repetitive doses of clodronate-loaded liposomes. Locomotor activity tests and weight change records showed a delayed and milder symptomatic phase in these animals. The upregulation of CD206+ cells, microglia, and astrocytes at the endpoint in the ventral horn of the depleted group appears to be associated with the anti-inflammatory phenotype of CD206+ cells, astrocytes, and microglia, correlating with improved motor behavior in this group.Amyotrofik lateral skleroz (ALS), ilerleyici kas atrofisi ile karakterize edilen tedavisi mümkün olmayan bir motor nöron hastalığıdır, bu atrofi solunum kaslarını da içerir. Kas zayıflığı, erime, kramplar ve fasikülasyonlar alt motor nöron kaybından kaynaklanır. Ayrıca, ALS'li hastalar frontotemporal kortekste nöron kaybı nedeniyle ekstra-motor belirtiler yaşayabilirler. Genellikle, hastalık başlangıcından sonra 2 ila 4 yıl arasında bir sürede solunum yetmezliği ölümün başlıca nedenidir. Yetişkinlerde en yaygın motor nöron hastalığı olan ALS'nin insidensi 100.000 başına 2 ve prevalansı 100.000 başına 5,4'tür. ALS patogenezine yönelik geniş kapsamlı çalışmalara rağmen, nörodejenerasyonun tam mekanizması net değildir. Perivasküler makrofajlar (PVM'ler), santral sinir sisteminde (CNS) bulunan miyeloid hücrelerdir ve CNS sınırı ile ilişkili makrofajlar olarak bilinen daha büyük bir makrofaj grubunun bir parçasıdır. Sağlıklı bir durumda, bu hücreler damardan sızan zararlı maddeleri fagosite eder ve bağışıklık yanıtlarını düzenler. Ancak, iltihaplı bir durumda, artmış vasküler geçirgenliğe ve sonrasında nöroinflamasyona katkıda bulunurlar. Kan-beyin bariyerinin (BBB) disfonksiyonu ALS'nin semptomatik aşamasından önce meydana gelir ve PVM'leri etkiler, bu da reaktif oksijen türleri (ROS) üretiminde ve BBB geçirgenliğinde artışa neden olur. Dönüşmüş PVM'ler, diğer beyin miyeloid hücreleri ile iş birliği yaparak proinflamatuar süreçleri başlatır. Amaç: Amacımız, PVM'lerin ALS patogenezine katkısını ve nöroinflamasyondaki etkilerini araştırmaktır. Bunun için, ALS'nin ön belirtili aşamasında PVM'leri azalttık ve bir hayvan modelinde mikroglia aktivasyonunu, astrogliyozu, BBB bozulmasını, semptomları ve yaşam süresini değerlendirdik. Yöntem: PVM azaltımı, ALS hayvan modeli olan SOD1(G93A) mutasyonlu sıçanların serebrospinal sıvısına klodronat yüklü lipozomlar veya PBS yüklü lipozomlar (bir kontrol olarak) enjekte edilerek sağlandı. Çalışma, 59 SOD1 mutasyonlu sıçanı (hem erkek hem de dişi) içeriyordu. Ön çalışmalar dokuz sıçanı kapsarken, kalan elli sıçana klodronat yüklü lipozomlar (azaltılmış grup) veya PBS yüklü lipozomlar (yalancı işlem grubu) serebral enjeksiyon yoluyla verildi. Süspansiyondaki klodronat konsantrasyonu 5 mg/ml idi. Sıçanlar üç deneye ayrıldı: erken tek enjeksiyon, geç tek enjeksiyon ve doğumdan sonra 80. günde, doğumdan sonra 160. günde ve doğumdan sonra 80. günde ardışık 20 günde bir iki ek enjeksiyon yapılan çoklu enjeksiyonlar. Sıçanlar, insan son noktasına ulaşana kadar izlendi, ağırlık haftada iki kez ölçüldü ve nöromüsküler kuvveti, motor koordinasyonu ve dengeyi değerlendirmek için haftalık olarak lokomotor aktivite testi yapıldı. Lokomotor aktivite testi, yürüme analizi, kuyruk kaldırma, denge tahtası testi, pençe kavrama dayanıklılığı, uzatma refleksi, dikme davranışı ve yürürken pençe yerleştirme doğruluğu için merdiven basamağı testini içeriyordu. Doğrulama çalışmaları, PVM'lerin SOD1 ve WT sıçanları arasında karşılaştırılması, enjeksiyon noktası doğrulaması ve PVM azaltımının doğrulanması için Sprague Dawley soyundan WT sıçanları içeriyordu. FITC-Albümin enjeksiyonu, beyne ve omuriliğe uygun teslimatı onaylayarak, sonraki çalışmalar için enjeksiyon noktasını doğruladı. sıçan modellerinden elde edilen doku örneklerinde astroglia, mikroglia ve CD206+ hücreler için immunofluoresan boyama, sırasıyla GFAP, Iba 1 ve CD206 primer antikorları kullanılarak gerçekleştirildi. İstatistiksel yöntemler, üç denemede azaltılmış ve yalancı işlem grupları arasındaki davranış skorlaması ve ağırlık değişikliğini analiz etmek için kullanıldı. Bulgular: SOD1 ve WT sıçanlarının CNS dokularında yapılan ön çalışmalar, SOD1 mutasyonlu sıçanların çeşitli beyin ve omurilik bölgelerinde CD206+ hücrelerin yukarı regülasyonunu gösterdi. FITC-Albümin enjeksiyonu, beyin ve omuriliğe uygun teslimatı onaylayarak, PVM'lerle kollokale olan enjeksiyon noktasını sonraki çalışmalar için doğruladı. WT sıçanların beyin ve omurilik kesitleri için CD206 ile immunofluoresan boyama, azaltılmış grupların tüm bölgelerinde CD206+ hücrelerin aşağı regülasyonunu gösterdi, özellikle çoklu enjeksiyon deneyi için omurilikte anlamlı sonuçlar elde edildi. Ağırlık değişikliği analizi, üç denemede azaltılmış gruplarda gecikmiş ön belirtili aşamayı gösterdi, çoklu enjeksiyon deneyi için anlamlı sonuçlar elde edildi. Davranışsal çalışmalar, azaltılmış gruplarda daha hafif veya gecikmiş semptomatik aşamaları, özellikle çoklu enjeksiyon deneyinde doğruladı. PVM'lerin, astrositlerin ve mikrogliaların immunofluoresan boyama ile ventral boynuzdaki tüm üç hücre tipinin upregülasyonunu, geç tek enjeksiyon ve çoklu enjeksiyon deneylerindeki azaltılmış gruba karşı yalancı işlem grubuna göre ortaya çıkardı. Sonuç: Bu çalışma, ALS'nin ön belirtili aşamasında perivasküler makrofajların tükenmesinin hastalık başlangıcını geciktirebileceğini, özellikle klodronat yüklü lipozomların tekrarlayan dozlarını alan hayvanlarda gösterdi. Locomotor aktivite testleri ve ağırlık değişikliği kayıtları, bu hayvanlarda gecikmiş ve daha hafif semptomatik aşama gösterdi. Azaltılmış gruptaki ventral boynuzdaki CD206+ hücrelerin, mikroglia ve astrositlerin upregülasyonu, bu gruptaki motor davranışların iyileştirilmesi ile ilişkili olan CD206+ hücrelerin, astrositlerin ve mikrogliaların anti-inflamatuar fenotipi ile ilişkili görünmektedir.