Impact of colistin resistance on adaptive virulence mechanisms of acinetobacter baumannii

Abstract

Colistin resistance in Acinetobacter baumannii is an emerging problem that limits antimicrobial therapy options. In this study, we aimed to identify the adaptation of A. baumannii to antimicrobial and environmental stress by interchanging virulence traits. This study included two patient cohorts. The first cohort consists of 2 pairs of colistin-susceptible (K408, K1007) and colistin-resistant (K409, K1006) clonal isolates from 2 individual patients. The second cohort consists of 21 isolates (ColS=11, ColR=10) from 21 patients. Colistin susceptible isolates were exposed to in vitro colistin induction for 50 generations with and without exposure to HgCl2. The selected cell populations of colistin-susceptible, resistant, and in vitro-resistant induced isolates were subjected to DNA and RNA sequencing and phenotypic assays. Comparative virulence traits were examined using SNP analysis, transcriptomic analysis, biofilm formation assay, C. elegans fertility assay, bacterial adherence, cellular internalization, and cytokine expression assays. In the in vitro colistin induction assay, K408 gained colistin resistance on the corresponding day of clinical resistance (K408-G25) and got resensitized to colistin in the consecutive generation (K408-G26) while K1007 did not gain colistin resistance amongst 50 generations. On the other hand, in the in vitro colistin and HgCl2 co-exposure, K408 and K1007 developed resistance on 3rd generation and 5th generation, respectively. A significant upregulation of ompW, ata, and adeFGH genes on K408-G25 was followed by a downregulation upon resensitization to colistin (G26). Despite the upregulation of the ompW gene in transcriptomic analysis, the ompW protein disappeared on K408-G25 and recovered in the resensitized generation (G26). In parallel, disrupted cell membrane integrity and serum resistance activity were recovered in K408-G26. The ΔompW K408 strain exhibited significant downregulation of OMPs (ompA, carO) and adeFGH efflux pump operon (p=0.0026). Bacterial adherence and intercellular internalization assays revealed that colistin-resistant isolates (K408 G25, K408HG3, K409) exhibited lower affinity of adherence and invasion compared to the colistin susceptible cells. In parallel, proinflammatory cytokine expression was significantly higher in colistin susceptible cells (p= 0.0395). In the 2nd cohort, ompW was significantly downregulated with lower protein abundance (p=0.004). Additionally, in the resistant cohort, the pmrCAB and adeFGH operons were significantly upregulated (p<0.001). Eventually, clinically colistin resistant and in vitro colistin resistance induced isolates (K408 G25, K408 HG3, K409, K1006) exhibited lower C. elegans virulence scores compared to the colistin susceptible (K408, K1007) and colistin resensitized (K408 G26) cells. These results were further confirmed by the second cohort with statistically lower virulence scores (p=0.0224). In this study, we showed that, during the early stages of response to colistin stress until the development of chromosomal resistance, Acinetobacter baumannii regulates adhesion, efflux pump, and serum resistance associated virulence traits. Moreover, mercury exposure plays an important role in facilitating colistin resistance. Colistin resistant cells lose their ability to cell invasion and intercellular persistence. Eventually, the ompW protein is an unstable outer membrane protein which may result in suboptimal outcomes for the ompW targeted immunisation strategies in the prevention of colistin resistant A. baumannii infections.Acinetobacter baumannii'de artan kolistin direnci antimikrobiyal tedavi seçeneklerini kısıtlayan bir problem haline gelmiştir. Bu çalışmanın amacı, A. baumannii patojeninin antimikrobiyal dirence ve çevresel strese karşı adaptasyonu boyunca değişkenlik gösteren virülans özelliklerini araştırmaktır. İki hasta grubundan oluşan bu çalışmanın ilk hasta grubunda, 2 hastadan izole edilen 2 çift kolistin duyarlı (K408,K1007) ve kolistin dirençli (K409, K1006) izolat bulunmaktadır. İkinci hasta grubu ise 21 hastadan izole edilen 21 adet (ColS=11, ColR=10) A. baumannii izolatından oluşturulmuştur. Kolistine duyarlı izolatlar in vitro ortamda 50 pasaj boyunca sadece kolistin ile ve kolistin+HgCl2 ile induklenmiştir. Kolistin duyarlı ve dirençli örnekler arasından seçilen örneklere DNA ve RNA tam genom sekansı ve fenotipik deneyler yapılmıştır. Değişime uğrayan virülans özelliklerini incelemek için karşılaştırmalı olarak SNP analizi, transkriptomik analizi, biyofilm oluşum deneyleri, C. elegans fertilite deneyi, bakteriyel aderans ve hücre içi ınvazyon deneyleri ile sitokin ekspresyon deneyleri yapılmıştır. İn vitro kolistin induklenen, K408 izolatı, klinik direncine karşılık gelen 25. Günde kolistine direnç geliştirmiş ve bir sonraki günde kolistine tekrardan duyarlı hale gelmiştir. K1007 izolatı 50 gün boyunca kolistin induklenmesine rağmen direnç geliştirmemiştir. Bunun yanısıra, kolistin ve HgCl2'nin eşzamanlı induklendiği deneyde ise K408 izolatı 3. günde, K1007 izolatı ise 5. günde kolistine direnç geliştirmiştir. Gen ekspresyon analizlerinde, ompW, ata ve adeFGH operonunun K408 G25'te istatistiksel olarak anlamlı yükselişi, 26. Jenerasyonda düşüşüyle sonuçlanmıştır. Transkriptomik analizlerde ompW geninin yüksek ekspresyona sahip olduğu görülse de, ompW proteinin K408 G25 izolatında kaybolduğu ve 26. Jenerasyonda geri kazanıldığı gözlemlenmiştir. Buna parallel olarak, K408 G25 izolatında gözlemlenen hücre membran bütünlüğünün bozukluğu ve serum direncindeki düşüş, 26. Jenerasyonda geri kazanılmıştır. ΔompW K408 susunda ise dış membran proteinlerinde (ompA, carO) ve adeFGH eflüks pompası operonunun ekspresyonunda istatiksel olarak anlamlı bir düşüş gözlemlenmiştir (p=0.0026). Bakteriyel aderans ve hücre içi ınvazyon deneyleri sonucunda, kolistin dirençli izolatların (K408 G25, K408HG3, K409) hücreye tutunma ve hücrenin içine girmekte düşük afınite gösterdiği gözlemlenmiştir. Buna parallel olarak, proenflamatuar sitokin ekspresyonu, kolistine duyarlı hücrelerde anlamlı olarak yüksek bulunmuştur (p=0.0395). İkinci çalışma grubundaki kolistin dirençli izolatlarda ise, ompW ekspresyonunun anlamlı olarak azaldığı aynı görülürken, protein bantlarının yoğunluğunda da azalma gözlemlenmiştir (p=0.004). Buna ek olarak dirençli çalışma grubunda, pmrCAB ve adeFGH operonlarının gen ekspresyonlarındaki artış istatiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0.001). Kolistine klinikte ve in vitro ortamda direnç geliştiren izolatların (K408 G25, K408 HG3, K409, K1006) C. elegans virülans skorlarının, kolistine duyarlı izolatlara kıyasla daha düşük skorlara sahip olduğu görülmüştür. Bu sonuçlar, 2. çalışma grubunda kolistine dirençli örneklerin virülans skolarında istatiksel olarak anlamlı bulunan düşüşü ile doğrulanmıştır (p=0.0224).Bu çalışmada, kromozomal kolistin direnç genlerinin yokluğunda Acinetobacter baumannii patojeninin erken yanıt olarak adezyon, eflüks pompası ve serum direnciyle ilişkili virülans özelliklerini regüle ettiğini gözlemledik. Bunun yanında, cıva maruziyetinin kolistin direnç kazanımını kolaylaştırdığını saptadık. Kolistin dirençli örneklerin, kolistin duyarlı örneklere kıyasla hücreye tutunma, hücreye girme ve hücredeki sürekliliğini devam ettirme kapasitesinin düştüğünü gözlemledik. Son olarak, ompW proteininin, sabit olmayan bir dış membran proteini olduğu ve bu proteinini hedef alan imünizasyon stratejilerinin kolistin dirençli A. baumannii enfeksiyonlarında efektif olmayacağı görülmüştür.