Targeted approaches reveal epigenetic regulation of lysosomal exocytosis contributing drug sensitivity and transcriptional activation

Abstract

The limited effectiveness of chemotherapy in many solid tumors often stems from intrinsic cellular mechanisms that reduce intracellular drug accumulation. One such mechanism is lysosomal sequestration followed by exocytosis, wherein chemotherapeutic agents are trapped within acidic vesicles and expelled from the cell, thereby diminishing cytotoxic efficacy. Although this process is increasingly recognized as a contributor to treatment failure, its upstream regulatory control has remained poorly defined. In particular, the role of chromatin-modifying enzymes in governing lysosomal dynamics has not been systematically investigated. This thesis explores the hypothesis that lysosomal exocytosis is subject to epigenetic regulation and that pharmacologic inhibition of specific chromatin-modifying enzymes may suppress vesicle-mediated drug clearance. A focused epidrug library comprising 175 small-molecule inhibitors was conducted to identify compounds that influence lysosomal exocytosis, vesicle accumulation, and cisplatin sensitization in cancer cells. Two inhibitors targeting Type I protein arginine methyltransferases (PRMTs) emerged as potent hits, significantly enhancing cisplatin cytotoxicity without causing baseline toxicity. These inhibitors reduced lysosomal exocytosis and increased lysosomal content independently of canonical transcription factors governing lysosomal biogenesis. Transcriptomic profiling following PRMT inhibition revealed suppression of chromatin maintenance and DNA repair pathways, alongside induction of oxidative stress and apoptosis-related genes. Gene set enrichment analysis further demonstrated enrichment of lysosome-related pathways, including vesicle-mediated transport and regulation of lysosomal enzymes, providing additional support for the impact of PRMT inhibition on lysosomal dynamics. Integration with public ChIP-seq datasets indicated that many differentially expressed genes are direct PRMT targets and the promoter occupancy of PRMTs to these target genes are further verified in ChIP-qPCR experiments. All of these findings were validated across multiple cell lines and extended to other lysosomally sequestered drugs, highlighting broader therapeutic relevance. Moreover, analysis of patient-derived transcriptomes demonstrated that high PRMT1 and PRMT6 expression correlates with poor chemotherapy response, reinforcing the clinical significance of epigenetic control over lysosomal exocytosis. To complement this insight, the second part of the thesis investigates whether epigenetic modifiers can also regulate the transcription of genes involved in lysosome-mediated metal homeostasis and drug resistance. A CRISPR/Cas9-mediated knock-in model was developed by inserting a firefly luciferase cassette into exon 1 of one ATP7B allele, generating a reporter cell line that preserves the endogenous chromatin environment. Screening the same epidrug library in reporter assay identified several histone deacetylase (HDAC) inhibitors as potent inducers of ATP7B transcription. These effects were validated through promoter-reporter assays, RT-qPCR, and chromatin immunoprecipitation, which showed a specific enrichment of H3K18 acetylation mark over H3K9 and H3K27 acetylation at the ATP7B promoter following HDAC inhibition. Importantly, this transcriptional activation was conserved across hepatic and non-hepatic cell types and occurred independently of ROS accumulation. Together, these studies uncover chromatin-level mechanisms that regulate both lysosomal drug efflux and the expression of a clinically relevant copper transporter. By identifying epigenetic targets that influence drug retention and gene activation, this work provides a conceptual and experimental framework for improving therapeutic strategies in cancer and metal storage disorders.Birçok solid tümörde kemoterapinin sınırlı etkinliği, sıklıkla hücre içi ilaç birikimini azaltan hücresel mekanizmalardan kaynaklanır. Bu mekanizmalardan biri, lizozomal hapsolma ve bunu takip eden ekzositozdur; bu süreçte kemoterapötik ajanlar asidik veziküller içinde hapsedilir ve hücre dışına atılarak sitotoksik etkinlikleri sınırlandırılır. Bu mekanizma tedavi başarısızlığına sebebiyet veren bir süreç olarak giderek daha fazla tanınsa da, söz konusu olayı düzenleyen mekanistik regülasyonlar hâlâ yeterince aydınlatılamamıştır. Özellikle, kromatin düzenleyici enzimlerin lizozomal dinamikleri nasıl kontrol ettiği sistematik olarak araştırılmamıştır. Bu tez, lizozomal ekzositozun epigenetik bir düzenlemeye tabi olabileceği ve belirli kromatin düzenleyici enzimlerin farmakolojik inhibisyonunun vezikül aracılı ilaç uzaklaştırımını baskılayabileceği hipotezini araştırmaktadır. Bu amaçla, 175 küçük molekül inhibitör içeren hedefe yönelik bir epigenetik ilaç (epi-ilaç) kütüphanesi taranmış ve lizozomal ekzositoz, vezikül birikimi ve sisplatin duyarlılığı üzerinde etkili bileşikler belirlenmiştir. Tip I protein arjinin metiltransferazlarını (PRMT'ler) hedefleyen iki inhibitör güçlü adaylar olarak öne çıkmış ve kendileri bazal toksisite oluşturmaksızın sisplatin sitotoksisitesini anlamlı düzeyde artırmıştır. Bu inhibitörler, lizozomal ekzositozu azaltmış ve Hücre içindeki lizozomal içeriği artırmıştır; üstelik bu etkiler lizozomal biyogenezden sorumlu kanonik regülasyon ve buna ait transkripsiyon faktörlerinden bağımsız olarak gerçekleşmiştir. PRMT inhibisyonunu takiben yapılan transkriptom analizleri, kromatin bakımı ve DNA onarım yollarının baskılandığını, oksidatif stres ve apoptoz ile ilişkili genlerin ise arttığını göstermiştir. Gen seti zenginleştirme analizleri, PRMT inhibisyonunun lizozomal dinamikler üzerindeki etkisini destekler nitelikte, vezikül aracılı taşıma ve lizozomal enzimlerin düzenlenmesi gibi lizozomla ilişkili yolların zenginleştiğini de ortaya koymuştur. Çevrimiçi erişilebilir ChIP-seq verileriyle yapılan entegrasyon, farklı şekilde eksprese edilen genlerin birçoğunun doğrudan PRMT hedefi olduğunu göstermiş ve bu genlerin promotör bölgelerinde PRMT bağlanmasının varlığı ChIP-qPCR deneyleriyle doğrulanmıştır. Tüm bu bulgular birden fazla hücre hattında doğrulanmış ve lizozomal olarak hapsedilen diğer ilaçlara da genellenerek terapötik etkinliğin daha geniş bir bağlamda değerlendirilebileceğini göstermiştir. Ayrıca, hastalara ait transkriptom analizleri, yüksek PRMT1 ve PRMT6 ekspresyonunun zayıf kemoterapi yanıtıyla ilişkili olduğunu göstermiş ve lizozomal ekzositozun epigenetik kontrolünün klinik önemini desteklemiştir. Bu bulgulara tamamlayıcı olarak, tezin ikinci bölümünde epigenetik düzenleyicilerin, lizozom aracılı metal homeostazı ve ilaç direnciyle ilişkili genlerin transkripsiyonunu da düzenleyip düzenleyemeyeceği araştırılmıştır. Bu amaçla, ATP7B genine alel spesifik "firefly luciferase" ekspresyon kaseti eklenerek CRISPR/Cas9 ile düzenlenmiş bir "knock-in" model geliştirilmiş ve böylece endojen kromatin ortamını koruyan bir raporlayıcı hücre hattı elde edilmiştir. Aynı epigenetik ilaç kütüphanesinin bu rapor sisteminde taranması sonucunda, bazı histon deasetilaz (HDAC) inhibitörlerinin ATP7B transkripsiyonunu güçlü şekilde indüklediği belirlenmiştir. Bu etkiler, promotör-raporlayıcı analizleri, RT-qPCR ve kromatin immünopresipitasyonu ile doğrulanmış; HDAC inhibisyonunu takiben ATP7B promotöründe H3K9 ve H3K27 asetilasyonuna kıyasla özellikle H3K18 asetilasyonunun arttığı gösterilmiştir. Önemli olarak, bu transkripsiyonel aktivasyon hem hepatik hem de hepatik olmayan hücre türlerinde korunmuş ve reaktif oksijen türleri (ROS) birikiminden bağımsız gerçekleşmiştir. Bu çalışmalar birlikte ele alındığında, hem lizozomal ilaç dışa atımını hem de klinik açıdan önemli bir bakır taşıyıcısının ekspresyonunu kontrol eden kromatin düzeyindeki mekanizmaları ortaya koymaktadır. İlaç tutulumunu ve gen aktivasyonunu etkileyen epigenetik hedeflerin tanımlanması yoluyla, bu tez kanser ve metal birikim hastalıklarında terapötik stratejilerin geliştirilmesine yönelik kavramsal ve deneysel bir çerçeve sunmaktadır.