Unraveling ovarian cancer stem cell dependencies on miRNA and epigenetic regulation utilizing enhanced 3D culture models

Abstract

High-grade serous ovarian cancer (HGSOC) is the deadliest gynecologic malignancy, largely due to therapy-resistant cancer stem cells (CSCs) that drive recurrence and poor clinical outcomes. This thesis aimed to establish reliable CSC models, uncover novel regulators of stemness, and investigate their mechanistic roles to inform therapeutic strategies. Two 3D culture methods—ultra-low attachment (ULA) spheroids and gelatin methacrylate photomask (GelMA-Pm) encapsulation—were optimized with OVCAR-3 and OVSAHO cell lines and validated in patient-derived samples. OVCAR-3 cells cultured in ULA formed compartmentalized spheroids with enriched CSC and epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) traits and multidrug resistance, making this the most robust system. Small RNA sequencing of spheroids identified hsa-miR-548ah-3p as a consistently downregulated and underexplored miRNA. Functional rescue with miRNA mimics reversed CSC characteristics, reduced drug resistance, and impaired migration and invasion. RNA-seq profiling under prolonged mimic treatment highlighted "rescue genes," including VIM, CXCR4, and KIT, integrating with miRNA target predictions. Parallel analyses revealed global 3′UTR lengthening in CSC spheroids, a dormancy-like program that remained responsive to miR-548ah-3p restoration. Complementing these findings, a CRISPR-Cas9 dropout screen with the EPI-KOL epigenetic library identified essential regulators of spheroid survival. Top dependencies converged on DNA damage response (ATM, BRCA1), polycomb and chromatin remodeling (SUZ12, EPC2, EP400, PBRM1), and RNA metabolism (SNRPF, SYNCRIP, PARG). In summary, this thesis integrates 3D culture modeling, miRNA functional studies, APA profiling, and CRISPR screening to reveal that HGSOC CSCs rely on a DNA damage–chromatin–APA axis. Restoration of miR-548ah-3p effectively counteracts CSC traits and drug resistance, nominating it—together with epigenetic regulators—as promising therapeutic entry points. These findings establish optimized 3D culture systems for CSC modeling and uncover mechanistic vulnerabilities that may guide future strategies to overcome resistance in HGSOC.

Yüksek dereceli seröz over kanseri (HGSOC), en ölümcül jinekolojik malignitedir ve bunun başlıca nedeni tedaviye dirençli kanser kök hücrelerinin (CSC) tümör nüksü ve kötü klinik sonuçları yönlendirmesidir. Bu tezde amaç güvenilir CSC modelleri kurmak, kök hücreselliği düzenleyen yeni unsurları belirlemek ve mekanistik rollerini aydınlatarak olası tedavi stratejilerine ışık tutmaktır. İki farklı 3D kültür yöntemi—ultra-düşük yapışma (ULA) sferoidleri ve jelatin metakrilat fotomask (GelMA-Pm) enkapsülasyonu—OVCAR-3 ve OVSAHO hücre serileri ile optimize edilmiş ve hasta kaynaklı örneklerde doğrulanmıştır. ULA ortamında kültüre edilen OVCAR-3 hücreleri, zengin CSC özellikleri, epitel-mezenkimal geçiş (EMT) belirteçleri ve çoklu ilaç direnci sergileyen bölümlenmiş sferoidler oluşturmuş ve en güvenilir model olarak belirlenmiştir. Küçük RNA dizilemesi, sferoidlerde hsa-miR-548ah-3p'nin anlamlı biçimde baskılandığını göstermiştir. Bu miRNA'nın mimik ile geri kazandırılması CSC özelliklerini tersine çevirmiş, ilaç direncini azaltmış ve göç/invazyon yeteneklerini zayıflatmıştır. Uzun süreli mimik uygulaması sonrası RNA-seq analizleri, VIM, CXCR4 ve KIT gibi "kurtarıcı genler"i ortaya çıkarmış ve miRNA hedef tahminleriyle uyumlu bulunmuştur. Paralel analizler CSC sferoidlerinde global 3′UTR uzamalarını, yani dormansi benzeri bir programı göstermiş; ancak bu desen miR-548ah-3p geri kazandırılması ile geri döndürülebilmiştir. Bulguları tamamlayıcı olarak, EPI-KOL epigenetik kütüphanesi kullanılarak gerçekleştirilen CRISPR-Cas9 taraması sferoidlerin yaşaması için gerekli düzenleyicileri ortaya koymuştur. En kritik bağımlılıklar DNA hasar yanıtı (ATM, BRCA1), polikomb/ kromatin yeniden şekillenmesi (SUZ12, EPC2, EP400, PBRM1) ve RNA metabolizması (SNRPF, SYNCRIP, PARG) üzerine yoğunlaşmıştır. Sonuç olarak bu tez, 3D kültür modellemeyi, miRNA fonksiyonel analizlerini, APA profilini ve CRISPR taramasını entegre ederek HGSOC kök hücrelerinin DNA hasarı–kromatin–APA eksenine bağımlı olduğunu ortaya koymaktadır. miR-548ah-3p'nin geri kazandırılması CSC özelliklerini ve ilaç direncini etkili biçimde tersine çevirmekte olup, epigenetik düzenleyicilerle birlikte umut verici terapötik hedefler olarak öne çıkmaktadır. Bu bulgular CSC modellemesinde optimize edilmiş 3D sistemler sunmakta ve direnç mekanizmalarını aşmaya yönelik stratejiler için yeni bir temel sağlamaktadır.