L-alanine dehydrogenase from vagococcus lutrae : structural analysis and industrial potential

Abstract

Abstract: L-Alanine dehydrogenase from Vagococcus lutrae (VlAlaDH) catalyzes the reversible oxidation-reduction reaction between L-alanine and pyruvate. The enzyme's ability to generate a valuable product in a single enzymatic step has increased interest in bacterial AlaDHs. In this study, a novel wild-type apo structure of AlaDH from under characterized organism is presented which could serve as a candidate for L-alanine production with minimal pyruvate byproduct. The discovery lays the groundwork for future studies for protein engineering has been laid. The structure was determined using highly complex experimental methodology of X- ray crystallography with the "Turkish Delight" diffractometer in the ambient temperature in near neutral pH. This approach enabled the determination of the apo-structure of VlAlaDH at 3.2 Å resolution revealing a homo-hexamer oligomerization with conserved Rossmann fold motifs. The main takeaway from the study was the enzyme retained the key motif architecture observed in each homolog structure. The retained motifs being one NAD+ -binding Rossmann fold connected with conserved 𝛼-helices linker to a second Rossmann fold which carried the catalytic residues for pyruvate and L-alanine. Notable differences were observed in the NAD+-binding Rossmann fold where it carried some similarities in residue level to a thermostable bacterial AlaDHs called Geobacillus kaustophilus and Thermus thermophilus. Specifically, residue 270 substituted from Asp to Gln, residue 240 also showed change from Val to Ile between Geobacillus kaustophilus, and between Thermus thermophilus and Vagococcus lutrae both carrying Ile at the residue number 198 but not the homologs. These residues participate in NAD+ binding into the cleft through hydrogen bonds and hydrophobic interactions. As the primary binding substrate being NAD+, these substitutions may be targeted for future studies. The phylogenetic tree further supports that even the evolutionary distance of the species shared common adaptations at coenzymelevel.

Özet: Vagococcus lutrae kaynaklı L-Alanin dehidrogenaz (VlAlaDH), L-alanin ve pirüvat arasın- daki geri dönüşümlü oksidasyon-redüksiyon reaksiyonunu katalizler. Enzimin tek bir en- zimatik adımda değerli bir ürün üretebilme yeteneği, bakteriyel AlaDH'lere olan ilgiyi artırmıştır. Bu çalışmada, karakterizasyonu sınırlı bir organizmadan elde edilen, yeni bir yabani tip AlaDH apo yapısı sunulmuştur. Bu yapı, minimal pirüvat yan ürünüyle L-alanin üretimi için bir aday olabilir. Bu keşif, gelecekteki protein mühendisliği çalışmaları için bir temel oluşturmaktadır. Yapı, "Turkish Delight" difraktometresi kullanılarak oda sıcaklığında ve nötr pH'a yakın koşullarda X-ışını kristalografisi yöntemiyle belirlenmiştir. Bu yaklaşım, VlAl- aDH'nin 3.2 Å çözünürlüklü apo yapısının belirlenmesini sağlamış ve korunan Rossmann katlanma motiflerine sahip homojen altımerik bir oligomerizasyon ortaya koymuştur. Çalışmanın temel bulgusu, enzimin her bir homoloğunda gözlemlenen ana motif mi- marisini koruduğudur. Korunan motifler, NAD bağlayan bir Rossmann katlanmasını, korunan -sarmallar ile bağlanmış ikinci bir Rossmann katlanmasına bağlayan bir yapıda bulunmuştur; bu ikinci katlanma alanı pirüvat ve L-alanin için katalitik amino asitleri içer- mektedir. NAD bağlayıcı Rossmann katlanmasında, Geobacillus kaustophilus ve Thermus thermophilus gibi termostabil bakteriyel AlaDH'lerle amino asit düzeyinde bazı benzer- likler gözlemlenmiştir. Özellikle, 270. pozisyondaki amino asit Asp'dan Gln'a değişmiş, 240. pozisyondaki amino asit Val'den Ile'ye dönüşmüş ve hem T. thermophilus hem de V. lutrae'de 198. pozisyonda diğer homologlarda bulunmayan bir İzolösin gözlemlenmiştir. Bu amino asitler, NAD'ın bağlanma yarığına hidrojen bağları ve hidrofobik etkileşimler yoluyla katılmaktadır. Ana bağlayıcı kofaktör NAD olduğundan, bu değişimler gelecek- teki mühendislik çalışmaları için hedeflenebilir. Filogenetik analiz, evrimsel olarak uzak türlerin kofaktör bağlanması düzeyinde ortak adaptasyonlar gösterdiğini desteklemektedir. Bu çalışma, bu yeni AlaDH yapısının homolog yapılarla karşılaştırmalı analizini de- taylı şekilde sunsa da, substrat veya kofaktörle birlikte kristalizasyon yapılmadığı için elde edilen sonuçlar deneysel olarak doğrulanamamaktadır. Ayrıca, L-alanin aşırı üre- timiyle karşılaştırılabilecek herhangi bir hedefe yönelik mutagenez çalışması da gerçek- leştirilmemiştir. Sonuç olarak, Vagococcus lutrae'ye ait L-alanin dehidrogenazın yapısal, dizisel, evrimsel ve hesaplamalı analizleri, substrat ve kofaktör bağlanma özellikleri hakkında önemli bilgiler sunmaktadır. Kristalleştirme veya mutagenez çalışmaları olmaksızın bile, bu çalışma VlAlaDH'nin gelecekteki protein mühendisliği çalışmaları için umut vadeden bir aday olduğunu göstermektedir. Bulgular ayrıca, L-alanin biyosentezinin endüstriyel üretimi açısından enzimin potansiyelini desteklemekte ve ileri optimizasyon çalışmaları için temel oluşturmaktadır.