Identification of differentially expressed ferroptosis-related hub genes and their association with cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease by informatic analysis

Abstract

Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) is a complex and progressive respiratory disorder, primarily resulting from exposure to cigarette smoke. The disease is characterized by chronic inflammation, oxidative stress, and irreversible destruction of lung tissue. Recent studies have revealed that ferroptosis, a regulated form of cell death driven by iron-dependent lipid peroxidation, plays a significant role in COPD pathogenesis. The aim of this study was to identify ferroptosis-related genes (FRGs) involved in cigarette smoke-induced COPD, and to investigate the expression of these genes in vitro. Initially, an integrative bioinformatic analysis was performed that was followed by in vitro cigarette smoke extract (CSE) exposure and expression analysis of target genes. The datasets used in this study were obtained from the Gene Expression Omnibus (GEO) database. Differentially expressed genes (DEGs) were identified through dataset analysis, and ferroptosis-related genes were extracted using the FerrDb database gene list. The MCODE method, which was integrated into the Metascape online tool, was employed to identify hub genes. Subsequently, protein-protein interaction (PPI) analysis, functional enrichment analysis, and miRNA-gene interaction studies were conducted for the hub genes. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was performed to analyse the expression of these hub genes after in vitro CSE exposure. Based on the analysis of multiple datasets and the FerrDb database, 20 FRGs involved in cigarette smoke-induced COPD were identified after removing redundant genes. MCODE analysis identified MDM2, EGFR, SRC, BRD4, GDF15, TP63, and CD44, as hub genes. Functional enrichment analysis revealed a strong association between these genes and ferroptosis-related biological pathways, including fatty acid and sulphur compound regulation that were mediated through the TP53 signaling pathway. miRNA-gene interaction analysis suggested that hsa-mir-203a-3p, hsa-mir-155-5p, and hsa-mir-34a-3p may regulate these genes. In vitro validation studies demonstrated that 24 hours incubation with CSE led to a significant reduction in the expression of six of the seven hub genes, except MDM2 gene in primary human bronchial epithelial cells (HBEC). However, CSE exposure did not cause any significant changes in the expression of genes studied in BEAS-2B cell line. In conclusion, we demonstrated the involvement of six ferroptosis-related hub genes in the pathogenesis of CSE-induced COPD by both bioinformatic tools and the validation by qRT-PCR. Our findings suggest that these genes may serve as potential targets for the diagnosis and treatment modalities of cigarette smoke-associated COPD; however, further studies are required.

Kronik Obstrüktif Akciğer Hastalığı (KOAH), esas olarak sigara dumanına maruziyet sonucu ortaya çıkan, karmaşık ve ilerleyici bir solunum hastalığıdır. Bu hastalık, kronik inflamasyon, oksidatif stres ve geri dönüşü olmayan akciğer dokusu yıkımı ile karakterize edilmektedir. Son dönemde yapılan araştırmalar, demir bağımlı lipid peroksidasyonu tarafından yönlendirilen düzenlenmiş bir hücre ölüm türü olan ferroptozun, KOAH patogenezinde önemli bir rol oynadığını ortaya koymuştur. Bu çalışmanın amacı, sigara dumanı ile indüklenen KOAH'ın gelişiminde rol oynayan ve ferroptoz ile ilişkili genleri (FRG'ler) belirlemek ve bu genlerin ekspresyon seviyelerini in vitro olarak araştırmaktı. Çalışmamızda öncelikle integrative biyoinformatik analiz gerçekleştirildi ve sonrasında in vitro sigara dumanı ekstraktı (CSE) maruziyeti ve hedef genlerin ekspresyon analizleri gerçekleştirildi. Çalışmada kullanılan veri setleri gen ekpresyon omnibus (GEO) veri bankasından elde edildi. Veri setlerinin analizi sonucu diferansiyel eksprese genler (DEGs) belirlendi ve bu genler içinden ferroptoz ile ilişkili olanlar FerrDb veri bankasındaki gen listesi kullanılarak ayrıştırıldı. Bu genler içinde hub genlerin belirlenmesi için Metascape online aracına entegre MCODE yöntemi kullanıldı. Daha sonra bu genler protein-protein etkileşim analizi, fonksiyonel zenginleştirme analizi ve merkezi ilişkiye sahip genler ve miRNA etkileşimleri analiz edildi. Daha sonra belirlenen merkezi genler in vitro CSE maruziyet deneyi sonunda kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile analiz edildi. Analiz sonuçlarına göre farklı data setlerinden belirlenen DEG'ler ve FerrDb veri bankası kullanılarak ferroptoz ilşkili genler belirlendi ve tekrarlı genler ayıklandıktan sonra sigara ile ilişkli KOAH'da rol oynayan ve feroptoz ilişkili 20 gen belirlendi. MCODE analizi sonucunda MDM2, EGFR, SRC, BRD4, GDF15, TP63 ve CD44 merkezi ilişkili genler olarak belirlendi. Bu genlerin fonksiyonel enrichment analiz sonucunda TP53 sinyallenme yolu ile ferroptozla ilişkili yağ asidi ve sülfür bileşenlerinin regülasyonunu içeren biyolojik sinyal yollarıyla güçlü ilişki saptadık. Bu genlerin miRNA ilişki analizinde hsa-mir-203'a-3p, hsa-mir-155-5p ve hsa-mir-34a-3p miRNA'larının bu genlerin ortak regülasyonundan sorumlu olabileceğini belirledik. In vitro validasyon analizimizde, 24 saat CSE maruziyeti primer insan bronş epitel hücrelerinde 7 ortak gen içinden MDM2'yu kontrole göre anlamlı düzeyde etkilemezken diğer genlerin ekspresyonunu anlamlı düzeyde azalttığını belirledik. Ancak, 24 saat CSE maruziyeti BEAS-2B hücrelerinde bu genlerin ekspresyonuna kontrole göre anlamlı düzeyde etki etmedi. Sonuç olarak, CSE kaynaklı KOAH patogenezinde ferroptoz ile MDM2 dışındaki altı ortak geninin qRT-PCR ile doğrulanan biyoinformatik analizlerle araştırılan ilişkisini ortaya koyduk. Elde ettiğimiz sonuçlara göre bu genler sigara ilişkili COPD'nin tanı ve tedavisinde hedef genler olabilir. Ancak, daha detaylı analizlerle verilerin doğrulanmasına ihtiyaç vardır.