Phenotypic and genotypic evaluation of azole resistance in aspergillus fumigatus ısolates from clinical and environmental specimens

Abstract

Aspergillus fumigatus can cause different clinical manifestations including chronic pulmonary infections, as well as invasive aspergillosis which is highly mortal in the immunocompromised host. Azole antifungal drugs, voriconazole in particular, are the first-line recommended therapeutic regimen. Azoles inhibit 14-alpha demethylase enzyme encoded by the cyp51A gene. In recent years, increased azole resistance is observed among environmental and clinical A.fumigatus isolates. Two different mechanisms have been proposed for the development of resistance. The first one is the triggering of resistance as a result of long-term clinical azole use. Point mutations in cyp51A gene are generally responsible for this type of azole resistance. The second mechanism is incidental environmental azole exposure due to the use of azoles as agricultural fungicides. Contact with azoles for extended periods and at varying concentrations causes selective pressure and mutations on sporulating A.fumigatus. Since the resistant strains may persist in nature, susceptible individuals may be infected by acquisition of these strains from the environment. When genotypically examined, the cyp51A gene of the resistant isolates of environmental origin specifically presents with a tandem repeat in the promoter region in addition to the point mutation in codon 98 (TR34/L98H). The aim of this study was to investigate azole resistance rates in A.fumigatus strains isolated from clinical specimens and landscaping areas around Hacettepe University Faculty of Medicine Hospital by phenotypical and genotypical methods. Agar screening test was used as the initial test to detect azole resistance in isolates identified as A.fumigatus sensu stricto according to thermotolerance test results. For all strains that grew on any of the azole containing plates in agar screening test, minimum inhibitory concentration (MIC) values were determined by "European Committee on Antimicrobial Susceptibilitiy Testing" reference microdilution method for the confirmation of the resistance. In addition, cyp51A gene sequence was investigated in selected isolates and mutation analysis was performed. A total of 483 clinical and 65 environmental A.fumigatus sensu stricto isolates were included in the study. The first group of clinical isolates consisted of 215 strains isolated in 1997-2015, revived from stock and tested. The second group consisted of 268 strains belonging to the time period of 2016-2018, during which routine azole agar screening tests were performed for A.fumigatus isolates. When all isolates (n=483) were evaluated together, 11 isolates (1 before 2015 and 10 between 2016-2018), were found to be resistant to itraconazole (2.3%). None of the mutations previously reported to be associated with azole resistance in Aspergillus strains that were detected in cyp51A sequence analysis, However, polymorphisms which are not (yet) fully elucidated in relation to the resistance (Y46F, G89G, V172M, T248N, E255D, L358L, K427E, C454C, Y431D and Q141H in one strain) were shown to exist in resistant isolates. These results have shown that the rate of azole resistance among clinical A.fumigatus isolates was low (2.3%) in our center. Further studies are required to demonstrate the possible role of the detected polymorphisms on azole resistance and to clarify other mechanisms related with high azole MIC values. In addition, since high azole resistance has been reported from one region in our country, it has been concluded that multicenter studies are required to determine the azole resistance status and the range for the azole resistance ratio in different regions and to reveal resistance mutations that may be specific to our country. / Aspergillus fumigatus bağışıklık sistemi baskılanmış konakta yüksek mortalite ile seyreden invaziv aspergillozun yanı sıra kronik pulmoner aspergillozu da içine alan farklı klinik tablolara neden olabilmektedir. Vorikonazol, aspergilloz tedavisinde ilk sırada tercih edilmesi önerilen antifungal ilaçtır. Vorikonazolün de içinde yer aldığı azol grubu ilaçlar, cyp51A geni tarafından kodlanan 14-α demetilaz enzimini inhibe eder. Son yıllarda yapılan çalışmalarda dünyada farklı merkezlerde çevresel ve klinik A.fumigatus izolatlarında artan azol direnci dikkati çekmektedir. Direnç gelişiminde iki farklı mekanizma öne sürülmüştür. Bunlardan ilki, klinikte uzun süreli azol kullanımına bağlı ortaya çıkan dirençtir. Bu yol ile gelişen azol direncinden genellikle cyp51A genindeki nokta mutasyonları sorumludur. İkinci mekanizma ise tarımda fungisit olarak azol kullanımına bağlı sekonder çevresel azol maruziyetidir. Uzun süreyle ve değişen konsantrasyonlarda azol bileşikleri ile temas, sporlanma sürecindeki A.fumigatus üzerinde seçici baskıya ve mutasyonlara neden olmaktadır. Azol direnci kazanan suşların doğada bulunması nedeniyle, duyarlı kişilerin bu suşları çevreden alarak enfekte olmaları mümkün olabilmektedir. Genotipik olarak incelendiğinde çevresel direnç kazanan bu izolatlarda genellikle cyp51A geninde 98. kodondaki nokta mutasyonuna ek olarak promotor bölgede “tandem repeat” (TR34/L98H) saptanmıştır. Bu çalışmanın amacı, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesinde klinik örneklerden ve hastane çevresindeki peyzaj alanlarından izole edilen A.fumigatus izolatlarında azol direnç durumunun fenotipik ve genotipik yöntemlerle araştırılmasıdır. Morfolojik özelliklerin incelenmesini takiben termotolerans testi ile A.fumigatus sensu stricto olarak tanımlanan izolatlarda azol duyarlılık durumunun saptanması için agar tarama testi uygulanmış, azol içeren plakların herhangi birinde üreme olan izolatlarda “European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing” referans mikrodilüsyon yöntemi ile minimum inhibitör konsantrasyonu (MİK) değerleri belirlenmiştir. Ayrıca seçili izolatlarda cyp51A geni dizisi incelenerek mutasyon analizi yapılmıştır. Çalışmaya klinik örneklerden 483, çevre örneklerinden 65 toprak A.fumigatus sensu stricto izolatı dahil edilmiştir. Klinik izolatların birinci grubu 1997-2015 yıllarına ait 215 izolattan oluşmuş ve retrospektif olarak test edilmiştir. İkinci grup ise A.fumigatus kompleksi için rutin azol agar tarama testinin yapıldığı 2016-2018 yıllarına ait 268 izolattan oluşmuştur. Tüm klinik izolatlar (n= 483) birlikte değerlendirildiğinde izolatlardan biri 2015 yılından önce, 10’u 2016-2018 yılları arasında olmak üzere 11 (%2.3)’i itrakonazole dirençli, 5 (%1)’i artmış maruziyette duyarlı (Intermediate-I) A.fumigatus izolatı saptanmıştır. Azole dirençli izolatlarda incelenen cyp51A geninde, Aspergillus izolatlarında azol direnci ile ilişkilendirilmiş mutasyonların hiçbiri saptanmamış ve bu dirençli izolatlarda, direnç ile ilişkisi henüz tam olarak aydınlatılamamış bazı polimorfizmler (Y46F, G89G, V172M, T248N, E255D, L358L, K427E, C454C, Y431D ve bir izolatta bu polimorfizme ek olarak Q141H) gösterilmiştir. Çalışmamızda A.fumigatus izolatlarında azol direnci düşük oranda (%2.3) saptanmıştır. Saptanan polimorfizmlerin azol direncine olası etkisinin gösterilmesi ve yüksek azol MİK değerleri ile ilişkili diğer mekanizmaların aydınlatılması için ileri çalışmalara gereksinim olduğu düşünülmüştür. Ayrıca ülkemizde bir bölgeden yüksek azol direnci bildirilmiş olması nedeniyle, farklı bölgelerde azol direnç durumunun ve azol direnci oranı için aralığın belirlenmesi ve ülkemize özgü olabilecek direnç mutasyonlarının açığa çıkarılması amacıyla çok merkezli çalışmaların gerekli olduğu sonucuna varılmıştır.